关于肾康丸对培养的大鼠系膜细胞增殖、细胞外基质分泌和细胞周期的影响

【摘要】 观察肾康丸对体外高糖培养的大鼠系膜细胞（MC）增殖、细胞外基质分泌（ECM）和细胞周期的影响。【方法】将16只Wistar雄性大鼠随机分为4组，即正常血清组，开搏通组（剂量为5ng/kg，肾康丸高、低剂量组剂量分别为2.4、1.2g/kg)，灌服相应药物7d，分离制备药物血清。将体外高糖（30mmol/LGlu）培养的MC分为5组：高糖模型组(30mmol/LGlu)，正常血清组(体积分数5%正常血清），开博通组（5%开博通血清）及肾康丸高、低剂量组（5%肾康丸高、低剂量血清），另设低糖（10mmol/LGlu）模型组。培养72h后，采用四甲基偶氮噬盐（MTT）法测定各组细胞增殖，双抗夹心酶联免疫吸附（ELISA）法检测上清纤维连接蛋白（FN）含量，流式细胞仪检测细胞周期。【结果】高糖培养的MC显著性增殖，上清FN含量显著性增加，并出现细胞周期异常，肾康丸能抑制MC增殖，减少FN分泌，并使Go/G期细胞比例显著性增加，而与期及G2/M期细胞比例减少。【结论】肾康丸可通过调整MC细胞周期异常，进而抑制高糖诱导的MC增殖和ECM分泌。
【关键词】 肾康丸 药理学 糖尿病肾病 中药疗法 细胞周期 胞培养 大鼠
　　糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）全身性微血管并发症之一，也是导致DM患者死亡的重要原因。约40％的Ⅰ型DM和5％～10％的Ⅱ型DM患者可以发生DN。DM可由多种途径损害肾脏，并累及肾脏的所有结构，从肾小球、肾血管直到肾小管和肾间质，随着病情的进一步发展，可影响肾功能不可逆转，最终导致终末期肾功能衰竭［1］。迄今为止，西医除强调控制血糖、血压外，对该病尚无特效药物。中药制剂肾康丸在临床用于治疗DN多年，具有确切的保护DM患者肾脏的作用［2-3］。肾小球系膜细胞（Mesangial cell，MC）的变化在肾脏疾病的发病中具有重要的作用［4］。为进一步探讨肾康丸治疗DN的作用机制，我们观察了肾康丸对体外高糖培养的MC增殖、纤维连接蛋白（Fibronetin，FN）分泌和细胞周期的影响，并与血管紧张素转换酶（Angiotensin converting enzyme，ACE）抑制剂开博通作对照。现报道如下：
　　1 材料与方法
　　1.1 动物和细胞株 Wistar雄性大鼠，体质量190～230g ，购于南方医科大学（原中国人民解放军第一军医大学）动物实验中心，合格证号：粤检证字第2004A031号；大鼠MC细胞株，购于武汉大学。
　　1.2 受试药品和主要试剂 肾康丸由黄芪、芡实、金樱子、玉米须、水蛭等组成，南方医科大学珠江医院药剂科生产，批号：20031214；开博通片由上海中美施贵宝药业有限公司生产，批号：0402032。RPMI1640干粉为美国GIBCO公司产品；小牛血清由杭州四季青生物工程研究所提供；四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲基亚枫（DMSO）、碘化丙啶（PI）染液、L谷氨酰胺和HEPES均为美国Sigma公司产品；丙酮酸钠为AMRESCO公司产品；RNA酶（Rnase）为上海生工产品；FN双抗夹心酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒由美国Diagnositca公司提供。
　　1.3 主要仪器 CO2培养箱由广东新绿洲生物技术研究所生产；XD101型倒置显微镜由南京江南光电股份有限公司提供；SWLG1F超净台由苏州安泰空气技术有限公司生产；Model ∑960型酶标仪为Meterech Inc公司产品；FACS20流式细胞仪为美国Becton diskson公司产品。
　　1.4 药物血清制备 16只大鼠随机分为4组：正常血清组，开博通组，肾康丸高、低剂量组。开博通组，肾康丸高、低组分别按5mg/kg、2.4g/kg和1.2g/kg（按照人与大鼠体表面积换算，分别相当于成人37.5mg/d、24g/d、12g/d，即相当于成人临床用量的1倍、2倍和1倍）灌服相应药物混悬液，连续7d。正常血清组灌服等体积生理盐水。最后1次灌药（灌药前禁食不禁水12h）1h后，30g/L戊巴比妥（1.5mL/kg）腹腔麻醉，腹主动脉采血，3000r/min，离心10min，分离血清，56℃，30min水浴灭活，0.22μm微孔滤膜过滤，分装，-20℃保存。
　　广州中医药大学学报2007年第24卷
　　第6期肖 炜，等.肾康丸对培养的大鼠系膜细胞增殖、细胞外基质分泌和细胞周期的影响
　　1.5 MC的培养与分组 MC加入含体积分数10%胎牛血清（FCS）的RPMI1640培养液（含200μg/mL青、链霉素及2.38g/LHEPES），置于37℃、体积分数5% CO2培养箱中培养，取4～8代MC 进行实验。每次实验前细胞经消化，1000r/min离心5 min，DHanks液洗涤，然后重悬细胞（1×105/mL）并用含体积分数1% FCS的RPMI1640培养液培养 24h，以使所有细胞同步化。同步化后，将MC分为5组：高糖模型组（体积分数1％ FCS、30 mmol/L Glu RPMI1640培养液），正常血清组（体积分数5％正常大鼠血清、体积分数1％FCS、30 mmol/L Glu RPMI1640培养液），开博通组（体积分数5％开搏通药物血清、体积分数1％ FCS、30mmol/L Glu RPMI1640培养液）及肾康丸高、低剂量组（体积分数5％肾康丸高、低剂量药物血清、体积分数1％ FCS、30mmol/L Glu RPMI1640培养液）。
　　1.6 MTT法检测MC增殖 MC同步化及分组同1.5。各组MC加入相应药物血清及不同葡萄糖的培养液后，置96孔培养板培养，6孔重复，培养72h后，吸取上清液，待测FN含量。各孔细胞加入5mg/mL的MTT溶液20μL，37℃，继续孵育4h。终止培养，吸弃上清液，每孔加入200μL DMSO，振荡裂解10min，使结晶物充分溶解。酶标仪双波长测定各孔吸光度值（D），以D值间接反映MC在培养孔中的增殖密度（D值越低则说明MC的增殖越弱）。测定波长为570nm，参考波长为630nm，酶标仪所示D值为D570减去D630，以消除非特异性光吸收效应。
　　1.7 ELISA法检测培养的MC上清FN含量 上述培养的各孔MC上清，用双抗夹心酶联免疫吸附（ELISA）法检测FN含量，按试剂盒说明书进行，根据标准品的标准曲线求出相应的含量。
　　1.8 流式细胞仪检测MC细胞周期 MC同步化及分组同1.5。各组MC加入相应药物血清及不同葡萄糖的培养液后，置25cm2细胞培养瓶培养，3瓶重复。培养72h后，弃上清，2.5g/L 胰酶消化，收集细胞，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2次，4℃、体积分数70%冷乙醇中固定。调整细胞浓度至1×105/mL，加入PI染料（其中PI 50mg/L，TritonX10010mg/L，RNase酶20mg/L）对DNA进行染色，避光孵育30min，流式细胞仪检测分析MC在各细胞周期（Go/G1、S、G2/M）所占比例，每组检测5000个细胞。
　　1.9 统计方法 采用SPSS13.0软件进行统计分析。
　　2 结果
　　2.1 药物血清对MC增殖和上清FN含量的影响
　　高糖模型组MC的D值和上清FN含量显著性高于低糖模型组（P＜0.01），表明高糖能促进MC增殖和FN分泌。与高糖模型组比较，开博通组，肾康丸高、低剂量组MC的D值和上清中FN含量均显著性降低（P＜0.05或P＜0.01），表明开搏通与肾康丸均能抑制高糖诱导的MC增殖和FN分泌。正常血清组与高糖模型组比较无显著性差异（P＜0.05），因此，正常大鼠血清无抑制MC增殖和分泌FN的作用。结果见表1。表1 药物血清对MC增殖和上清FN含量的影响①：P＜0.01，与低糖模型组比较(vs the lowglucose model group)；②：P＜0.05，③：P＜0.01，与高糖模型组比较(vs the highglucose model group)（下同）表2 药物血清对MC细胞周期的影响
　　Table 2 Effect of different medication serum on the cell cycle of MC(±s)p/%
　　组别(Groups)NG0/G1SG2/M低糖模型组(lowglucose modeo)381.19±1.468.82±0.799.99±1.34高糖模型组(highglucose model)361.23±1.78①23.39±0.79①15.38±1.51①正常血清组(normal serum)363.90±1.6321.55±1.6714.55±3.29开博通组(capoten)379.63±0.62③10.87±1.10③9.50±1.34③肾康丸高剂量组(highdose SP)382.31±1.30③9.31±0.41③8.38±0.90③肾康丸低剂量组(lowdose SP)373.79±1.37③14.99±0.14③11.21±1.32②
　　2.2 药物血清对MC细胞周期的影响
　　如表2及图1所示，高糖组与低糖组相比G0/G1期细胞显著性减少，而S及G2/M期细胞显著性增加（P＜0.01）。与高糖组比较，开搏通、肾康丸高、低剂量组G0/G1期细胞显著性增加（P＜0.01），S及G2/M期细胞显著性减少（均P＜0.05或P＜0.01），表明开博通与肾康丸均能改善高糖导致的MC周期异常。正常血清组与高糖模型组比较无显著性差异（P＜0.05），因此，正常大鼠血清无改善MC细胞周期异常的作用。 　　3 讨 论
　　MC处于肾小球毛细血管丛小叶间的轴心或围绕在小球毛细血管周围，是肾脏3种固有细胞中反应最活跃的细胞，具有单核-巨噬细胞样功能，可以吞噬和处理免疫复合物，清除沉积的大分子蛋白质，维持肾小球滤过膜的通透性，并可产生细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）和多种细胞因子。在正常情况下，MC的数量、形态和位置保持相对稳定，是肾小球形态和功能的重要组成部分。而病理状态下，MC出现异常增殖，并伴随ECM积聚和多种介质的释放，是导致多肾脏疾病包括DN发生发展和肾小球硬化的重要一环［4］。MC增殖、肥大和ECM分泌过多是DN早期的病理学特征之一，一般在DM患者作出临床诊断时即己存在［5］。Ⅰ型和Ⅱ型DM患者及链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）诱导的DM大鼠都存在这些病理表现。因此，如何抑制MC增殖和ECM分泌过多，成为延缓DN发生发展的关键。FN主要由MC产生，它不仅是ECM的重要成分，而且在病理情况下也参与肾小球损伤及硬化过程。一般认为，在肾小球病变或肾内细胞损伤早期，作为防御代偿机制FN可随细胞增生、ECM增加而增多，或促进MC等吞噬和清除肾内异物，或吸引单核巨噬细胞局部浸润。然而在损伤等因素排除后，FN和其他ECM成分继续随细胞增殖而积聚则可能是肾小球硬化的基础。
　　高血糖一直被认为是与DM各种并发症关系最为密切的因素之一，许多学者研究发现，高糖培养MC与DN大鼠存在着相同的病理过程［6］。本研究也发现高糖模型（30mmol/L）组与低糖模型（10mmol/L）组比较，MC显著性增殖，FN分泌水平显著性增加，说明高糖能促进MC增殖及ECM分泌。肾康丸高、低剂量组均能抑制高糖诱导的MC增殖，减少FN分泌，为其在临床上治疗DN提供了实验依据。肾脏细胞的增殖调节最终发生在细胞周期水平上，细胞顺序完成一个细胞周期就完成一次增殖。根据细胞增殖情况，分化成熟的细胞可以分成3类：持续分裂细胞，终末分裂细胞和暂时休止细胞。MC属于最后一类。在分裂原刺激下，MC活化，离开休止期（G0）进入细胞周期的G1期。当细胞通过G1期后便进入合成DNA的S期，此后便是G2和有丝分裂M期。其中只有G0/G1期时间变化较大，是细胞周期的关键和限速阶段。本研究发现，高糖组MC的G0/G1期的细胞比例显著性减少，而S期及G2/M期细胞比例显著性增加，说明高糖可以通过影响MC细胞周期，促进细胞增殖和分泌。肾康丸高、低剂量组G0/G1期的细胞比例均明显增加，S期及G2/M期细胞比例显著性减少，说明肾康丸可以通过改善高糖诱导的MC细胞周期变化，阻止MC进入增殖期，从而抑制MC增殖和ECM分泌。有研究显示肾康丸组方中一些中药具有抑制MC增殖的作用。如黄芪等提取液喷雾干燥粉末可以抑制高糖引起肾小球MC增殖［7］，水蛭中的水蛭素能够显著下调凝血酶介导的MC增殖［8］。此外，有人认为体内过多的葡萄糖是一种内生的甘浊之邪，根据五味理论，酸能克甘，因此酸味药物可以克制和消除体内的甘浊之邪，而其实验结果也表明酸味中药山楂对高糖培养下的MC有保护作用［7］。
　　综上所述，肾康丸组方可以抑制高糖诱导的MC增殖和ECM分泌，其作用机制与调整MC细胞周期异常有关。

参考文献

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