新型分子烙印聚合物的制备及在药物分析中的应用

【摘要】 介绍了分子烙印技术的基本原理、新型分子烙印聚合物（MIP）包括水相中MIP和球形MIP的制备，并综述了分子烙印聚合物在手性药物分离、中药研究以及药物传输等方面的最新应用。认为MIP作为色谱固定相，在手性药物的拆分中显示出选择性好、分离效率高等优点；作为固相萃取剂，可简化分离过程，提高分离效率；在药物传输系统中，可作为中药特定药效部位的载药系统。MIP技术在药物研究领域中发挥着越来越大的作用。
【关键词】 分子烙印聚合物；手性药物/分离与提纯；中药分析化学
　　设计并合成能与生物分子如抗体、酶、受体等识别系统相媲美的分子识别系统一直是化学和分子生物学领域的研究热点。分子烙印技术是20世纪90年代发展起来的一种新兴的分子识别技术，基于该技术制备的分子烙印聚合物（MIP）由于其优越的分子识别能力，因而在手性药物分离、固相萃取、化学传感器以及临床药物分析等领域均具有广泛的应用前景。近年来针对MIP的优化设计、合成工艺、识别性能及其应用的研究，已吸引了国内外众多学者的关注。
　　１分子烙印聚合物的制备原理
　　
　　分子烙印技术是针对特定的研究对象（烙印分子或称模板分子），制备一种对目标化合物具有特定选择性和亲和性的分子识别材料的技术。它是通过以下3个步骤实现的：（1）首先选择合适的带烯键的功能单体和模板分子结合形成单体/模板复合物；（2）引入合适的交联剂和致孔剂，与单体/模板复合物通过聚合反应形成高度交联的多孔共聚物，从而将功能单体的功能基在空间排列和定位上固定下来；（3）通过一定的方法将模板分子洗脱，这样就在高分子的共聚物中留下了模板分子的三维空穴，见图1所示。由于此空穴是根据模板分子“量身裁衣”定做的，它的空间形状、大小与模板分子完全匹配，孔穴体内腔表面基团与模板底物所含基团电子特征高度互补，因此对模板分子具有良好的记忆效应，在一定条件下，它可以重新选择性地结合模板分子。MIP引进识别孔穴的模型主要有两种：共价（预聚合）和非共价方式（自组装）。前者是指模板分子与功能单体通过可逆的共价键结合起来，交联后，通过一定的溶剂破坏形成的共价键，得到一种具有空腔的MIP，其主要的反应类型有形成西佛碱（schiff base）［1］、缩酮或缩醛［2］、碳酸酯［3］、硼酸酯［4］等。这种方法的优点是单体和烙印分子可定量结合形成稳定的复合物，所得的烙印聚合物所含的烙印孔穴密度较高，且无随机分布的非识别基团存在。因此，此类聚合物对模板分子具有较高的专一识别性。缺点就是共价键的结合能量大，烙印分子的抽提较为困难，其次在MIP的再识别过程中，模板与功能基结合的动力学速率慢，不能满足快速分离的需要。自组装是指在聚合反应前，可聚合的小分子单体如甲基丙烯酸、乙烯基吡啶、丙烯酰胺等功能单体与带有作用基团的模板分子在有机相溶液中通过弱的氢键、离子键（静电作用）、金属螯合、ππ电荷转移、偶极—偶极等弱的非共价键进行自组装。这种方法制备的MIP后处理（除去烙印分子）非常简单，其后续分子识别过程也更接近于那些天然的分子识别系统，如酶和底物、抗体和抗原等。因此目前绝大多数MIP均是通过非共价方法制得的。
　　图1分子烙印聚合物制备过程示意图　略
　　2新型分子烙印聚合物的制备及特性　
　　21水相中MIP的制备及特性在制备非共价型的MIP时，一般极性强的溶剂会降低烙印分子与功能单体的结合，特别是干扰氢键的形成，使生成的MIP识别性能较差。因此在非共价烙印中，大多是在弱极性或非极性有机介质（如苯、甲苯、二甲苯、氯仿、二氯甲烷、环己烷等）中进行，但它无法满足水溶性烙印分子对烙印环境的需要。近年来关于水相中MIP的制备报道日益增多。其中较多是采用金属配位的方法，其做法是采用金属螯合型功能单体与模板分子在水相或强极性溶剂中形成络合物，然后加入交联剂、引发剂聚合得到金属离子配位的MIP［5］。由于识别作用力是金属配位作用力，因此金属配位模板聚合物可以用于那些氢键易被破坏或干扰的体系，如水相中的分子识别。而对于一些无作用基团或不溶于弱极性有机溶剂中的模板分子，如果其可以和环糊精形成包合物，引入环糊精作为功能单体不失为一种理想的选择。这种方法不仅可以在水/有机溶液中制备，而且对烙印一些含有两个以上疏水性基团（如苯环或萘环）的模板分子非常有效［6］。到目前为止，大部分的MIP都是通过采用含有烯键的功能单体和交联剂通过自由基引发聚合得到的有机高聚物。而采用溶胶—凝胶法制备无机或有机—无机杂化的分子烙印材料，是目前出现的一项新的研究课题，这种技术与高分子聚合的区别在于聚合过程中使用了硅烷化的功能单体（如三甲氧基硅烷丙羧酸或三甲氧基硅烷丙酰胺等）和交联剂（如四甲氧基硅烷和四乙氧基硅烷等），在酸性催化下，硅氧烷发生一系列的水解、缩聚反应，从而得到高度交联的硅材料［7］。同有机聚合方法相比，溶胶—凝胶法不受有机溶剂限制，可以在水相环境中进行，而且溶胶—凝胶过程具有操作条件温和、成膜厚度均匀等优点，因此特别适合制备基于不同形状基质上的“镀膜”材料［8］。
　　22球形MIP的制备及特性MIP的制备通常采用本体聚合法（bulk polymerization），该法的优点就是合成条件易于控制，实验装置简单，便于普及。但得到的聚合物呈块状，需要经过研磨、筛分、沉降才能得到一定粒径的无定形产物，这个过程费事费力，产率较低，将其作为HPLC固定相时，会影响色谱柱填充的规则性，造成色谱峰扩宽和拖尾现象［9］。为了获得较好色谱分离性能的固定相，有必要将MIP制成均匀的球形颗粒。在一般高分子反应中，悬浮聚合是一种制备球形粒子的优良方法，Mayes等［10］使用液态全氟烃代替水作为聚合分散相，避免了水分子对模板—单体复合物的干扰，但这种分散相比较昂贵，在一般实验室不易普及。为此，Ye等［11］发展了一种沉淀聚合法，通过加入过量的溶剂使聚合的粒子从溶剂相析出，此方法的优点是不需要任何的分散剂，后处理简单，而且所制备的MIP呈纳米级的球形粒子。Yoshida等［12］则采用乳液聚合的方法将含有烙印分子（或离子）的水相（W1）与含有交联剂、乳化剂、功能单体的油相（Ｏ）混合，经过超声处理形成W1/Ｏ反相乳液，将此反相乳液再分散到外部水相中（W2），形成Ｗ1/Ｏ/W2复合乳液，然后再加入引发剂引发聚合，得到球形的MIP，该方法的最大特点就是解决了水溶性模板分子如氨基酸和金属离子的烙印问题。最近我们研究组以3～5?μm的聚苯乙烯为种子，采用两步种子溶胀和热聚合方法，制备得到均匀的球形MIP，但由于这种反应是在水油两相中进行的，模板分子必须具有较强的碱性或酸性作用基团，能与互补的功能单体在种球溶胶中形成较强的离子键［13］。目前看来，接枝聚合法是一种制备球形MIP的理想方法，通过引入一定的球形载体（如大孔树脂、球形硅胶）为基质，在其表面“镀上”一层薄的、三维的分子烙印层，这样制备的分子识别孔穴附在基质表面，从而有利于模板分子的接近。因此，这种表面烙印技术可用于烙印一些较大的分子如多肽、蛋白质和糖类等化合物。如Kempe等［14］以金属螯合型单体在乙烯化的硅胶颗粒上对核糖核酸酶Ａ进行烙印，利用核糖核酸酶Ａ分子含有的组氨酸残基与功能基上金属离子进行螯合作用，在硅胶表面成功地引入了对模板分子具有特异性识别的分子孔穴。
　　3分子烙印聚合物在药物研究中的应用
　　31MIP在手性药物分离中的应用
　　手性药物的两个对映体理化性质相近，但在人体内所表现出的生理活性通常不同，往往一种对映体有效，而另一种无效或甚至具有副作用，故药物的对映异构体分离对于安全用药具有十分重要的意义。鉴于传统的色谱固定相暴露出的选择性差、分离效率低、分析时间长等弱点，探索新型、高效的药物分离技术已成为该领域的焦点。MIP作为色谱固定相，凭借其优良的立体专一识别能力，在手性药物拆分领域已显示出良好的应用前景。同其他类型的色谱固定相相比，MIP具有如下优势：（1）具有较高的机械稳定性、耐高温、高压及酸碱条件；（2）对模板分子具有可预见的选择性，可预测手性对映体的洗脱顺序（即出峰顺序）；（3）由于MIP是以模板分子“量体裁衣”制作的，一些难以在常规手性固定相上分离的化合物有可能通过MIP得以拆分；（4）MIP固定相不仅对模板分子具有很好的手性分离能力，而且对模板分子结构相似的对映体具有一定的交叉分离能力［15］。迄今为止，MIP应用最多的是作为高效液相（HPLC）的固定相，拆分的对象主要包括一些氨基酸及其衍生物、糖类化合物、二肽、杀虫剂和一些临床手性药物分子等［16］。MIP在薄层色谱（TLC）中的应用研究较少，研究的报道也仅包括一些α受体激动剂［17］，其中的原因主要是因为MIP粒子制板困难，其次是在分析过程中，由于MIP中残留的模板分子往往会干扰被分析物的紫外检测，而使用显色剂显色又容易破坏薄层板的结构，影响薄层板的重复使用，因此应用起来具有一定的困难，但只要解决了MIP的铺板和显色问题，其作为TLC固定相用于手性拆分的前景是不容否定的。MIP在色谱方面的另一个重要应用是将其与毛细管电泳或毛细管电色谱（CEC）相结合。与HPLC相比，CEC具有更突出的优点，分离效率比HPLC高，分析速度快，分析结果重现性好，因而有望成为分离手性药物分子的一种新型手段。利用MIP进行分离的技术主要包括以下类型：分散聚合的MIPCEC柱［18］，整体聚合的MIPCEC柱［19］，混合丙烯酰胺凝胶填充的MIPCEC柱［20］、内壁键合的开管MIPCEC柱［21］。
　　32MIP作为固相萃取（SPE）剂在中药研究中的应用
　　传统的固相萃取剂有反向型、正向型、离子交换型等。这些吸附剂与被分析物间的作用都是广泛的、非特异性的，因此分离过程和洗脱条件的选择非常烦琐。将MIP作为SPE的吸附剂，由于其特定的亲和性和选择性，不仅克服了传统固相萃取剂专一选择性不高的缺陷，而且使分离过程大大简化，分离效率却大大提高。目前，MIP作为固相萃取剂通常用在环境污染物的监控、食品、农产品和中药材的农药残留检测［22］以及生物样品（血液、血浆、体液或组织）中的药物及其代谢物的分离与分析方面［23］。MIP作为SPE应用于中药系统是一个新的研究领域。中药体系是一个复杂的天然组合化学库，所包含的化合物结构类型多样，有效成分含量低，在中药的传统分离中，许多有效成分因为含量低微而难以纯化或筛选出来。而MIP作为固相萃取剂，不仅能对中药中某一特定的模板分子具有高度亲和性，而且对与模板分子结构类似的化合物亦表现出较高的结合能力。MIP的这些分子识别特点，使其很可能发展为一种高选择性分离材料，有效地分离纯化中草药中特定的模板分子或具有特定结构的药效部位。最近，徐筱杰研究小组［24］以中药黄酮化合物槲皮素分子为模板制备分子烙印聚合物，并将其作为固相萃取的填料，已成功地用于中草药银杏叶中槲皮素和山柰酚的提取。他们还将MIP制作固相萃取（SPE）柱与HPLC或质谱联用，实现了中草药中有效成分的分离、富集及在线鉴定一体化［25］，此技术并可进一步应用于中药有效成分的质量监控及中药指纹图谱的制作。除此以外，MIP在中药新药开发方面也具有较好的应用前景。在药物筛选过程，一些高毒性或高活性的抑制剂由于副作用太大，往往无法成药，因此寻找一些高效无毒的抑制剂替代品具有重要的意义。而中药体系（包括复方）经过人们几千年的积累和临床药理试验，一般具有较低的毒副作用，若以一些高毒性抑制剂烙印的MIP，可以直接从构型丰富的中药组合化合库中筛选出其他有效并且低毒性的化合物作为替代品或者先导化合物。
　　33MIP在药物传输系统（DDS）的应用
　　目前MIP作为药物传输系统的研究还处于初步阶段，但已倍受关注。MIP一个最主要的特点就是可以作为载体携带一簇结构类似的分子群，因此非常适合作为中药特定药效部位的载药系统。作为治疗的药物分子（烙印分子）或其类似物分散在MIP三维孔穴中，聚合物作为药物载体不仅对药物具有保护作用，而且由于烙印分子与MIP的高度亲和性，药物释放具有缓释性，因此对于一些在高浓度下产生毒副作用的药物，基于MIP的DDS系统显得更加具有优势。通过对MIP功能单体或者交联剂进行修饰，也可使MIP药物释放具有可控性和靶向性，能随外部条件如pH、光、热等的变化而改变药物释放量。可以想象利用MIP的交叉反应活性，以药物分子的类似物为烙印分子制备MIP，这种吸附有药物分子的高聚物进入人体后，如果人体内存有该种烙印分子，则其会同药物分子对高聚物产生竞争性吸附，从而导致药物分子的逐步释放。作为体内DDS的MIP不仅一般要能降解，而且它首先应具有一定的机械性和灵活性，不仅可以维持分子烙印孔穴的形状，同时又可确保一定的生物粘附性和生物相溶性，不会对细胞、组织或器官因机械摩擦而产生损伤；其次用于DDS的MIP应具备足以抵御各种酶和化学物质侵袭的能力，以便适用于复杂、多变的体内环境；再者用作DDS的MIP应无毒，其中残留的有机溶剂和功能单体应清洗干净，避免对细胞产生损害。目前大部分的MIP药物缓释系统的尝试还都在体外进行，Allender等［26］将以甲基丙烯酸为功能单体制备心得安MIP用作经皮给药装置的赋型剂，在水—乙醇（体积比为50∶50）的介质中进行扩散实验，结果表明含MIP的给药装置的释药速度明显低于不含MIP的给药装置，具有明显缓释效应。此外，AlvarezLorenzo等［27］制备了噻吗心安（timolol）分子烙印聚合物的眼内释药的软隐形镜，在37℃的人工制作泪液中可持续释药10?h以上。
　　34MIP在其他方面的应用
　　MIP除了上述应用外，还可用作生物传感器的敏感部件［28］。与传统的生物敏感材料相比，MIP具有耐酸碱和有机溶剂、不易变性、可重复使用等优点，常被比作“塑料抗体”，因此最有希望成为传感器中生物材料的理想替代品。另外在免疫分析方面，许多研究表明MIP能作为自然抗体的人造变体用于免疫检测的识别元素，例如咖啡碱和茶碱的识别［29］。 　　4存在问题及展望
　　MIP作为一种具有优良亲和性和选择性的识别材料，在短短的近10年来取得了飞速发展。但这项技术毕竟还很年轻，仍然存在许多尚未解决的问题，包括MIP的分子识别机理、模板分子的“渗漏”及在亲水体系中对核糖、蛋白质和DNA等大分子的烙印问题均有待深入研究。此外，大部分的研究表明聚合物在特异性地结合模板分子的同时，还一定程度上存在非特异性吸附，这对痕量组分的分离与富集是尤为不利的。目前许多研究小组通过寻找和开发新的功能单体、交联剂以及新的聚合工艺来致力解决这些问题。采用计算机辅助设计方法和组合技术对模板分子、功能单体、交联剂以及致孔剂等聚合参数进行优化，有望实现MIP的快速和半自动化制备［30］。总之，分子烙印作为一门极具发展潜力的分子识别技术，给我们展示了一个美好的前景。随着对分子烙印技术研究的不断深入，这门技术必将在药物研究领域中发挥越来越大的作用。

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