关于鸟氨酸脱羧酶表达水平与溃疡性结肠炎病变时相的关系

　　　　　　 作者：李茹柳 迟莉 郭文峰 徐颂芬 潘怀耿 陈蔚文

【摘要】 【目的】观察鸟氨酸脱羧酶（ODC）表达水平与不同时相溃疡性结肠炎(UC)模型大鼠结肠病理变化的关系。【方法】Wistar大鼠60只，随机分为正常组（12只），模型1、2、3组（各16只），以90?mg/kg三硝基苯磺酸（TNBS）结肠注射复制UC模型，分别于实验第10、20、30天处死模型1、2、3组大鼠，正常组于第30天处死；分别对各组大鼠结肠进行大体和组织病理学评分，并采用免疫组化法检测结肠ODC的表达。【结果】随着实验周期的延长，模型大鼠结肠病变从急性炎症、组织坏死向慢性炎症、溃疡修复进展，ODC在正常结肠粘膜低表达，在溃疡形成、组织坏死阶段的表达略高于正常组，在溃疡修复、细胞大量增生时ODC表达明显增强，在病灶修复处于稳定阶段时ODC表达有所回落。【结论】不同时相UC模型大鼠结肠ODC表达变化特点与结肠病理变化特点相符。
【关键词】 结肠炎，溃疡性；肠粘膜/病理学；鸟氨酸脱羧酶；疾病模型，动物；大鼠
　　【Objective】To investigate the relationship between ornithine decarboxylase (ODC) expression and pathological changes in ulcerative colitis (UC) at different periods.
　　
　　【Methods】Sixty Wistar rats were randomized into normal group (n=12) and model groups 1，2 and 3 (n=16 in each group). UC animal models in model groups 1， 2 and 3 were induced by colonic injection of 90?mg/kg TNBS (2，4，6trinitrobenzensulfonic acid)， and were executed respectively in 10th， 20th and 30th day after the modeling. The rats in the normal group were executed in 30th day after the modeling. Scoring of macroscopical features and pathological features was carried out in different groups and ODC expression in the colon was detected by immunohistochemistry assay.
　　
　　【Results】With the prolongation of the experimental period，pathological changes in UC rats developed from acute inflammation and tissue necrosis to chronic inflammation and ulcer recovery. ODC was expressed in the colon of normal rats， and the level was higher in the period of ulceration and tissue necrosis in the model group than that in the normal group， increased obviously in the period of ulcer recovery and cell proliferation， and slightly decreased in the stable stage of ulcer recovery.
　　
　　【Conclusion】ODC expression level in the colon of UC rats varies in the different pathological stages， and the changes of ODC expression are accorded with the pathological characteristics.
　　Key words:COLITIS， ULCERATIVE;INTESTINAL MUCOSA/pathology;ORNITHINE DECARBOXYLASE;DISEASE MODELS，ANIMAL;RATS
　　溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）主要症状有腹痛、腹泻、粘液脓血便、里急后重等，常反复发作，病程呈慢性经过，发作期与缓解期交替。三硝基苯磺酸（trinitrobenzensulfonic acid，TNBS）是一种抗原物质，与大分子组织蛋白质结合后成为一种抗原物质，引起机体免疫反应，可诱发动物溃疡性结肠炎的发生，其病理特点呈慢性炎症变化，与人类溃疡性结肠炎相似［1］。鸟氨酸脱羧酶（ornithine decarboxylase，ODC）是细胞内多胺合成过程中的第一个调节酶，而多胺是细胞增殖、分化和移行的基础性物质，因此ODC对细胞生长具有重要的调节作用，对组织损伤后的修复也有重要意义［2］。肠粘膜损伤后ODC通过大量表达来促进细胞的增殖、分化和移行，因此其可作为粘膜损伤程度及修复效果的一个标志。本实验在TNBS致大鼠溃疡性结肠炎模型上，观察ODC表达水平对溃疡性结肠炎大鼠结肠病理变化的影响。现报道如下。
　　1材料与方法
　　11实验动物Wistar大鼠，雌雄各半，体质量（230±20）?g，SPF级，广州中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SLXK（粤）20030001，粤监证字2005A008。
　　12试剂和仪器TNBS为Sigma公司产品，分子量2932，试剂浓度017?mol/L（50?g/L)，批号：014K5007；ODC单克隆抗体为Sigma公司产品，批号：025K5013；链霉亲和素—生物素—过氧化物酶复合物（ABC）免疫组化试剂盒为北京中杉金桥公司产品，批号：192005；Eclipse E200型光学显微镜为日本尼康公司产品。
　　13分组、造模与取材大鼠分为模型组（48只）和正常组（12只），参照文献［1］方法将TNBS原液与无水乙醇以1∶1比例（体积比）混匀，按大鼠禁食后体质量计算需注入的药液体积。模型组大鼠禁食不禁水24?h，乙醚麻醉，从大鼠结肠以90?mg/kg剂量注入TNBS药液，造模后正常饲养；按随机数字表所示再分为3组，每组16只，分别在实验的第10、20、30天处死（称为模型1、2、3组）。正常组大鼠不造模正常饲养至30?d处死。实验过程中每日观察大鼠一般状态、死亡情况，称体质量并记录，死亡大鼠解剖观察结肠病变情况。实验结束时处死每组存活大鼠，迅速剖开结肠后，4℃生理盐水冲洗干净，中性福尔马林固定24?h后石蜡包埋，切片，苏木素—伊红（HE）染色作组织病理学检查，并以免疫组织化学法检测ODC表达情况。
　　14结肠病变肉眼评分标准0分：结肠无损伤；1分：结肠轻度充血水肿；2分：结肠明显水肿，肠粘膜粗糙呈颗粒状；3分：结肠粘膜溃疡形成，溃疡最长径≤1?cm；4分：结肠粘膜溃疡形成，溃疡最长径介于1～2?cm之间；5分：结肠粘膜溃疡形成，溃疡最长径≥2?cm；6分：结肠全段的肠壁坏死或大鼠死亡。
　　15肠组织病理学评分标准参照文献［3］所述。①上皮细胞：正常形态为0分；有杯状细胞丢失为1分；杯状细胞大面积丢失为2分；隐窝细胞丢失为3分；隐窝细胞大面积丢失为4分。②炎细胞浸润：无浸润为0分；浸润在隐窝基底层为1分；浸润到达粘膜肌层为2分；浸润深入到粘膜肌层，伴随粘膜增厚和明显水肿为3分；浸润到达粘膜下层为4分。每只大鼠总评分为上皮细胞评分+炎细胞浸润评分。
　　
　　16免疫组化法检测ODC表达按ABC免疫组化试剂盒说明书操作。ODC蛋白主要表达在肠粘膜层上皮细胞中，胞浆中有棕色颗粒者为阳性表达细胞。结果分析参照文献［4］所述方法，在显微镜（400倍）下寻找1个ODC表达最明显的视野，计算阳性表达细胞占细胞总数的百分比，ODC表达强度评分分为5个等级：不表达为0分，表达低于10%为05分，10%～20%为1分，21%～30%为2分，31%～40%为3分。另设阴性对照片。
　　17统计学处理结肠病变肉眼评分、病理组织学评分、ODC表达评分的组间差异均以SPSS?100统计软件包进行秩和检验。
　　2结果
　　21大鼠一般状态观察大鼠造模后4?d内饮水和尿量明显增多，饮食减少，体质量下降，活动减少，皮毛松耸，排稀烂便或粘液便；造模后7?d状态最差，体质量平均下降20?g左右；8?d饮食量开始回升，体质量不再下降，以后逐渐上升，30?d时平均体质量比造模前增加20～40?g。造模10?d内大鼠处于病变较严重阶段；10～20?d状态好转，饮食增多，多数大鼠以排稀便为主，基本不见粘液便；20～30?d基本处于恢复期，此时动物活动较多，饮食恢复正常，多数大鼠排便虽未完全成形但水分明显减少。
　　22结肠病变肉眼观察模型1、2、3组分别死亡3、2、3只大鼠，死亡大鼠见结肠明显坏死，呈黑褐色，有的出现肠穿孔。模型1组存活的13只大鼠第10天处死时，结肠全部出现明显的溃疡病灶，结肠明显充血，溃疡病灶明显覆盖黑褐色坏死组织，有的呈火山口状，有的见明显脓状物，有的见全段肠壁坏死。模型组2组存活的14只大鼠第20天处死时，有12只出现溃疡性结肠炎病灶，2只以肠粘膜水肿为主；结肠病灶部位有的粘膜增厚变硬或凹陷，有的肠段变宽、粘膜增粗，但溃疡病灶黑褐色坏死组织较少。模型3组存活的13只大鼠第30天处死时，有8只出现溃疡性结肠炎病灶，5只以肠粘膜水肿为主。正常组大鼠未见死亡，结肠肉眼观察未见异常。各组大鼠结肠病变肉眼评分情况见表1。结果表明，随着实验周期延长，大鼠结肠病变程度逐渐减轻。
　　23结肠组织病理学检查各组存活大鼠作组织病理学检查。正常组大鼠结肠粘膜上皮完整，腺体排列规则，结构清楚，无溃疡。模型1组大鼠均可见明显的溃疡，大片坏死组织，溃疡底部有渗出物和坏死层等，上皮细胞明显破坏，溃疡病灶处粘膜明显缺损，炎细胞浸润均可达粘膜下层甚至浆膜。模型2组大鼠大多数都有溃疡出现，上皮细胞破坏较明显，炎细胞浸润大部分到达粘膜下层，在粘膜和粘膜下层可见由成纤维细胞、毛细血管、炎细胞构成的肉芽组织增生，大片坏死组织的出现少于模型1组。模型3组部分大鼠见溃疡出现，但上皮细胞破坏程度和炎细胞浸润深度不同，有的见早期瘢痕层形成，有胶原纤维增生；有的呈明显的慢性炎症，粘膜下层增厚，大量淋巴细胞增生，局部形成淋巴滤泡。各组大鼠结肠组织病理学评分情况见表2。结果表明，随着实验周期延长，结肠病变由急性炎症、组织坏死向慢性炎症、溃疡修复发展。
　　24ODC蛋白表达情况正常组大鼠肠粘膜结构正常，ODC表达在肠上皮细胞的胞浆处，作为其表达阳性信号的棕色颗粒排列较整齐，但表达较弱（图1-a）。模型1组溃疡性结肠炎急性炎症明显，组织标本普遍出现了广泛坏死，在坏死组织中，已没有原来的结肠结构，粘膜层缺失，只见明显的炎细胞浸润，在这些视野里没有见到ODC表达的棕色颗粒，说明ODC不表达在溃疡病灶处炎细胞中；个别标本溃疡病灶旁的结肠粘膜可见ODC表达增强，提示在溃疡病灶旁边可出现ODC表达升高的现象（图1-b）。模型2组溃疡性结肠炎由急性炎症向慢性炎症发展，溃疡病灶进入修复阶段，组织标本ODC表达普遍增强，在炎细胞浸润周围的腺上皮细胞内，可见明显的、排列整齐的ODC表达增强的信号，本组标本ODC表达最强（图1-c）。模型3组溃疡性结肠炎处于慢性炎症、溃疡修复阶段，组织标本仍可见ODC表达增强，但增强的程度逊于模型2组（图1-d）。各组ODC表达情况见表3，结果显示，溃疡性结肠炎不同病变阶段均可见ODC表达增强
　　表1各组大鼠结肠病变肉眼评分比较　略
　　表2各组大鼠结肠组织病理学评分比较　略
　　3讨论
　　ODC与肠细胞的增殖和分化密切相关，正常肠粘膜组织中ODC表达较低，细胞增殖时ODC活性升高，含量上升，催化更多的鸟氨酸合成多胺以促进细胞增殖分化，ODC的活性和含量是肠粘膜细胞增殖状态的一个标志［5］。肠粘膜损伤性疾病中ODC表达的改变有不一致的研究。Pillai等［6］发现儿童炎症性肠病患者结肠内ODC活性比正常人升高，且感染程度越高ODC活性越高，应用糖皮质激素治疗病情好转后，ODC活性降低。还有国外学者 ［7-8］研究了ODC在炎症性肠病不同分期中的变化，结果发现炎症性肠病患者病变部位和非病变部位ODC的含量都低于正常对照组；程度严重的克隆氏病患者ODC含量比中等程度的病人明显降低；中等和重度病变的溃疡性结肠炎患者中，病变部位的ODC都明显低于非病变部位。这种差异可能与疾病的愈合趋势有关，ODC大量表达时细胞有增殖的基础，往往可以迅速愈合。Obayashi等［９］发现溃疡性结肠炎活动期病人ODC活性、ODC mRNA都低于溃疡愈合期病人和正常人，这可能是

　　表3各组大鼠结肠ODC表达强度评分比较　略
　　图1各组大鼠结肠ODC表达情况(略)
　　溃疡活动期病人的愈合趋势不如愈合期病人的原因。但ODC变化在肠粘膜损伤性疾病中所代表的意义，目前尚不十分明确。本研究是在肠上皮细胞株上观察益气健脾中药有效部位对细胞增殖、移行、分化、ODC表达影响等的基础上［9-15］，进一步观察溃疡性结肠炎动物模型不同时相肠粘膜损伤和修复过程中ODC变化以及结肠病理改变情况。结果表明，结肠肉眼和病理学评分，模型1组与模型2组组间比较均有显著性差异（P＜005），而模型2组与模型3组比较均无显著性差异（P＞005），表明实验早期与中期比较，病变程度有明显差异，而实验中、后期之间的变化则相对平缓。ODC在正常肠粘膜上皮细胞上表达较低，发生溃疡性结肠炎病变时其表达明显改变，且在病变的不同阶段ODC的表达存在差异。实验早期病变最严重时ODC的表达相对较少，这与病灶部位肠粘膜明显缺失、组织坏死、细胞新生少有关；实验中期ODC表达最强，可能是溃疡进入修复阶段，需要细胞的大量增殖，作为细胞增殖过程中的启动因子之一，ODC表达增强有利于细胞的增殖；实验后期ODC表达较实验中期时有所下降，可能与多数大鼠溃疡修复处于比较稳定的状态，细胞增殖也趋于稳定有关。ODC评分模型1组与模型2组比较具有显著性差异（P＜005），而模型2组与模型3组比较无显著性差异（P＞005），这与结肠病变肉眼和病理评分的变化特点一致。溃疡性结肠炎作为一种粘膜损伤性的疾病，其病变修复过程中需要大量细胞增生，ODC在其中的变化和作用值得关注。已有研究表明ODC在溃疡性结肠炎动物模型中起保护性作用，使用ODC的特异性抑制剂二氟甲基鸟氨酸（DFMO）后溃疡性结肠炎的炎症程度增加 ［5］。本实验结果也提示在大鼠溃疡性结肠炎病变发展过程中，ODC的表达发生变化，其变化与溃疡修复时细胞增殖的速度以及病灶愈合的程度有关，但ODC在溃疡性结肠炎发生发展过程中确切的病理生理作用仍需进一步研究。

参考文献

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