积雪草离体培养和快速繁殖方法研讨

作者：贺红，张燕玲，吴立蓉，谭霭伦，林小桦，张桂芳

【摘要】 【目的】探讨采用植物组织培养技术进行积雪草快速繁殖的方法，为积雪草的人工栽培及优良品种选育奠定基础。【方法】以积雪草的带节茎为材料，研究离体培养与植株再生的过程。【结果】Murashge and Tucker（MT）基本培养基加N苯基N′1，2，3噻二唑5脲（TDZ）05?mg/L，有利于丛生芽的产生，不定芽诱导率为876%；根的诱导以MT+吲哚乙酸（IAA）02?mg/L培养基较好，生根率为100%，且植株生长旺盛。试管苗移栽，成活率可达90%左右。【结论】在MT培养基中加入TDZ可增加积雪草带节茎组织培养的成芽率，移入添加02?mg/L IAA的MT培养基中培养可增加其生根率，该方法为积雪草工厂化离体繁殖奠定了基础。
【关键词】 积雪草/生长发育；离体培养；中药培育
　　
　　【Objective】To find out technological evidence for the rapid propagation of Centella asiatica（L.） Urb..
　　
　　【Methods】The nodular stem segment of Centella asiatica（L.）Urb.was taken as the explant to induce fascicular bud.
　　
　　【Results】MT culture medium with 05?mg/L thidiazuron(TDZ) added was effective to induce the bud formation，and the shooting rate was 876%.As for the induction of rooting，MT culture medium with 02?mg/L indoleacetic acid (IAA) added was optimal，the rooting rate being 100% and the plant growing well.The survival rate of the transplanted testtube plantlet arrived 90%.
　　
　　【Conclusion】MT culture medium with TDZ added can increase the shooting rate of nodular stem segment of Centella asiatica（L.）Urb.，and MT culture medium with 02?mg/L IAA can increase the rooting rate of the bud，indicating that this method can serve as the preliminary invitro propagation system for Centella asiatica（L.）Urb..
　　Key words：CENTELLA ASIATICA(L.) URB./ growth && development；INVITRO CULTURE；MEDICINAL HERB ANIMAL RAISING
　　积雪草Centella asiatica（L.） Urb.，又名崩大碗，为伞形科植物，以全草入药。积雪草性寒、味苦、辛，具清热利湿、解毒消肿的功效［1］，临床上用于湿热黄疸、痈疮肿毒、跌打损伤、解砒霜中毒、覃中毒、解暑、传染性肝炎、流行性脑脊髓膜炎等。积雪草产于印度、日本、中国、印度尼西亚、南非、斯里兰卡等国，在我国主要分布于江苏、浙江、福建、江西、广东、广西等省区。积雪草作为草药使用在我国已有数千年历史，其有效组分积雪草总甙在国内外也广泛应用于临床［2］。目前，积雪草主要依赖于野生资源，难以满足临床及中成药生产的需要，同时，大量采挖野生药材，造成资源枯竭及生态环境的恶化。因此，开展积雪草的人工栽培是一种必然趋势。如何在短期内提供大量优质的积雪草种苗，是首先要解决的问题。本文以积雪草带节茎为材料，研究其离体培养的过程，为积雪草人工栽培及优良品种选育奠定基础。
　　１材料
　　11植物材料积雪草采自广西野生资源，经广州中医药大学药用植物教研室潘超美教授鉴定为伞形科植物积雪草Centella asiatica（L.） Urb.，取其带节茎段，进行表面消毒和培养。
　　12离体培养根据试验要求，选用的基本培养基为Murashge and Tucker (MT)，根据试验的不同阶段添加不同浓度的植物激素：不定芽分化试验添加6苄基腺嘌呤（6benzylaminopurine，BA）、N苯基N′1，2，3噻二唑5脲（thidiazuron，TDZ）；根的诱导试验添加萘乙酸（naphthalene acid，NAA）、吲哚丁酸（indolebutyric acid，IBA）及吲哚乙酸（indoleacetic acid，IAA）。每天光照12?h，培养温度为（26±1）℃。
　　2方法与结果
　　21无菌材料的获得取积雪草带节茎段，以蒸馏水冲洗干净后，用体积分数为70%的乙醇浸泡30?s，转入1?g/L的升汞溶液中浸泡消毒6?min，再用无菌水漂洗5～8次，把残留升汞漂洗干净，接种于诱导不定芽分化的培养基中进行培养。
　　22不定芽分化截取无菌苗的带节茎段，分别移入MT+05?mg/L BA及MT+05?mg/L TDZ的培养基中，培养初期，茎段及茎节处有所膨大，茎段保持绿色。15?d后从茎节处陆续长出不定芽，开始仅长出少量芽（图1），随着培养时间延长，芽的数量增多，形成丛生芽（图2）。在MT+05?mg/L BA培养基中，仅少量外植体能诱导出芽，且芽数很少，生长缓慢；而在MT+05?mg/L TDZ培养基上诱导出的芽明显增多。结果表明，MT+05?mg/L TDZ更有利于丛生芽的产生，不定芽诱导率达876%（见表1）。 　　23根的诱导积雪草组培苗在没有添加激素的MT培养基上，亦能少量生根。为了促进根生长旺盛，截取无根苗，分别移入MT+02?mg/L NAA、MT+ 02?mg/L IBA及MT+ 02?mg/L IAA的培养基中。培养10?d左右，开始生根。从3种培养基的生根效果来看，添加02?mg/L NAA时，生根率为100%，且长出大量的根，但由于根的生长过度，使得植株获得的营养少，苗基本上不生长，甚至有部分叶片发黄；经02?mg/L?IBA处理后，根的数目较少，生根率和生根数都不理想；而在MT+02??mg/L IAA培养基中，生根率为100%，且根的数目较多，植株生长良好，叶片的数目增多。结果表明，MT+02 ?mg/L IAA培养基更有利于生根（见表2、图3）。
　　24试管苗移栽试管苗移栽能否成活，是用组培法进行快速繁殖的重要一环。生根试管苗经过移栽后，能长出新根和根尖，并能从土壤中或其他栽培介质中吸取水分及养分，才能成活。方法是选取已生根的健壮积雪草试管苗，移栽到已消毒细沙中，在小苗上罩上塑料袋保湿，让幼苗在自然光下锻炼，添加MT培养液作养分，待生长稳定，长出新叶后移栽于露天种植，观察其成活率，一般成活率可达90%左右（图4）。
　　表1不同植物激素对外植体出芽的影响　略
　　表2不同植物生长素对生根的影响　略　
　　3讨论
　　随着积雪草应用的日趋广泛，人们在积雪草资源鉴定、化学成分、药理作用及临床应用方面做了大量的研究工作［2-5］，但有关栽培技术及资源再生方面研究较少。KwangSu Kimd等采用积雪草幼嫩叶柄进行离体培养，观察到细胞胚胎发生和植株再生的过程，但植株再生的时间较长，且成苗率不高［6］。国内相关的研究尚未见报道。TDZ是人工合成的苯基脲衍生物，是一种新型的植物生长调节剂，有研究比较了6种噻二唑脲类衍生物和另外3种吡啶脲类物质的细胞分裂素活性，发现TDZ是最强的一种。他们分别用大豆愈伤组织及烟草分化材料等为试材进行了TDZ生理活性测试实验，并与组织培养中常用的嘌呤类细胞分裂素BA、玉米素（ZT）、6糠氨基嘌呤（KT）等进行比较。结果表明，TDZ具有很高的细胞分裂素活性，它的活性要比一般的分裂素高几十倍至几百倍［7］。近年来，人们通过对它诱导形态发生的研究，逐渐揭示其作用机理，表明它可以促进植物芽的再生和繁殖，打破芽的休眠，促进种子萌发，促进愈伤组织生长，延缓植物衰老等［7-9］。本试验在诱导积雪草带节茎不定芽的发生时，分别使用了BA与TDZ，表明TDZ诱导丛生芽的效果明显优于BA。这是因为TDZ具有强烈的细胞分裂素的作用，因而具有明显促进腋芽增殖的效应。诱导腋芽增殖是快速无性繁殖的重要途径，它既能保持物种的遗传特性，又能在短期内大量繁殖，实现工厂化育苗。TDZ的问世，可能使一些难以离体再生植物的离体培养获得较为理想的效果，从而促进植物组织培养工作的更广泛开展。本文研究了积雪草离体培养的过程，获得了较高的植株再生频率，为积雪草的人工栽培及野生抚育提供了良好的组织培养再生体系，为积雪草资源的可持续利用奠定基础。
【参考文献】
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　　［2］陈瑶，秦路平，郑汉臣，等.积雪草的资源分布与生药鉴别［J］.中国中药杂志，2000，25（4）：199.

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　　［4］陆顺芳.积雪草的抗癌作用［J］.中草药，1996，27（9）：573.

　　［5］Kumar M H，Gupta Y K.Effect of different extracts of Centella asiatica on cognition and markers of oxidative stress in rats［J］.Journal of Ethnopharmacology，2002，79（2）：253.

　　［6］秦路平，庄卫国，郑汉臣，等.积雪草研究进展［J］.国外医药·植物药分册，1997，12（4）：154.

　　［7］Mok M C，Mok D W S，Armstrong D J.Cytokinin acitivity of Nphenyl1，2，3thidiazol5ylurea（TDZ）［J］.Phytochemistry，1982，21：1509.

　　［8］徐晓峰，黄学林.TDZ：一种有效的植物生长调节剂［J］.植物学通报，2003，20（2）：227.

　　［9］陈云风，张春荣，黄霞，等.TDZ对植物体细胞胚胎发生的作用［J］.植物生理学通讯，2006，42（1）：127.