电针对血管性痴呆大鼠学习记忆能力的改善作用及其机理研讨

　　　　　　作者：闫兵，许能贵，唐纯志，何利雷，绍瑛

【摘要】 【目的】观察电针对血管性痴呆(vascular dementia，VD)大鼠学习记忆能力的影响及其可能的机理。【方法】选择SPF级成年健康SD大鼠50只，随机抽取8只大鼠为假手术组，其他42只均采用4血管阻断法复制缺血模型。将造模成功的大鼠按随机数字表法分为电针组、尼莫通组和模型组。假手术组和模型组同等条件下饲养，未予任何治疗。电针组针刺模型大鼠头部百会穴，背部双侧膈俞穴、脾俞穴和肾俞穴，连接电针仪，施以连续波，频率150?Hz，1次/d，连续治疗15?d。尼莫通组模型大鼠给予尼莫通12?mg/kg，1次/d，连续15?d。治疗15?d后采用Morris水迷宫学习记忆行为测试法测定大鼠学习记忆能力，采用双波长分光光度计法检测大鼠血浆CO含量，分光光度比色法测定缺血脑组织中NO的含量。【结果】模型大鼠表现出明显的学习记忆障碍，在水迷宫实验中，其逃避潜伏期显著性延长，在原平台象限跨越相应平台次数与其他3个象限无显著性差异，血浆CO和脑组织NO水平显著性升高。而电针组逃避潜伏期较模型组显著性缩短，相同时间内跨越原平台次数显著性多于其他3个象限，血浆CO和脑组织NO含量较模型组大鼠显著降低(均P＜005或P＜001)。【结论】电针治疗血管性痴呆的作用可能与其改善VD大鼠学习记忆能力，显著性降低血浆CO和脑组织NO含量有关。
【关键词】 痴呆，血管性/针刺疗法；疾病模型，动物；穴，百会；穴，膈俞；穴，脾俞；穴，肾俞；大鼠

　　
　　【Methods】Fifty specific pathogen free(SＰF) adult rats were randomized into four groups. Except the 8 rats in the pseudooperation group (group A)， the other 42 rats were induced cerebral ischemia by fourvessel occlusion method.Then the model rats were randomized into model group (group B)， EA group (group C) and nimotop group (group D). Groups A and B were fed with the same forage and received no medication. Group C received EA on the acupoints of Baihui， Geshu， Pishu and Shenshu， and EA was set in continuous wave with the frequency being 150Hz， once per day and lasting 15 consecutive days. Group D received nimotop 12mg/kg， qd， for 15 consecutive days. After 15day treatment， the learning and memory abilities of the rats were observed by Morris water test， the plasma carbon monoxide (CO) level was detected by doublewavelength spectrophotometer， and brain nitric oxide (NO) content was examined by spectrophotometrycolorimetry.
　　
　　【Results】The model rats had obvious disorders of learning and memory， their escape latency was prolonged， the times swimming across the platform in the original quadrant did not differ from those in the other three quadrants， and plasma CO and cerebral NO levels were obviously increased. In EA group， escape latency was shortened， the times swimming across the platform in the original quadrant were more than those in the other three quadrants， and plasma CO and cerebral NO levels were obviously decreased (Ｐ＜005 or Ｐ＜001 as compared with those in the model group).
　　
　　【Conclusion】The therapeutic mechanism of EA improving learning and memory of VD rats may be related with the decrease of plasma CO and cerebral NO levels.
　　Key words: DEMENTIA， VASCULAR/acupuncture therapy;DISEASE MODELS， ANIMAL;POINT GV20(BAIHUI);POINT BL17(GESHU);POINT BL20(PISHU);POINT BL23(SHENSHU);RATS
　　血管性痴呆(vascular dementia，VD)是最常见的老年痴呆之一，而在血管性痴呆中又以缺血性脑血管病继发的血管性痴呆比率居首位［１］。目前，针灸治疗脑病的临床疗效是确切的，特别是针灸治疗VD疗效显著。有研究显示针刺治疗VD与调控细胞、保护缺血后神经元、调节神经介质含量与活性等作用相关［2］。CO和NO是人体的气体信息分子，在脑缺血性损害后显著升高，并在缺血性脑损伤后期表现出神经毒性作用［3］，这可能是最终导致血管性痴呆发生的原因之一。本实验观察针刺对全脑缺血模型大鼠的学习记忆能力以及血浆CO和脑组织NO含量的影响，现报道如下。
　　 1材料与方法
　　11主要仪器SDQ30双极射频电凝器(上海手术器械厂)；Morris水迷宫(广州中医药大学提供)；G860电针仪(上海)，多功能酶标仪(TECANGENios)，高速冷冻离心机(美国BECKMAN，型号CS15R Centrifuge)，匀浆机(德国IKAⅠ型)，722型分光光度计(上海)。
　　12动物、分组及造模［４］SPF级健康成年SD大鼠50只，雌雄各半，体质量180～220?g，由广州中医药大学实验动物中心提供(合格证编号：0010134、0010190)。随机抽取8只大鼠作假手术组，其他42只均采用4血管阻断法复制模型。以100?g/L水合氯醛(35?mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，背侧颈正中切口，暴露双侧第一颈椎横突冀小孔，用直径05?mm电凝针插入双侧翼小孔烧灼双侧椎动脉，造成永久性闭塞；以庆大霉素注射液局部涂擦伤口后用1号缝合线缝合伤口；然后，于腹侧颈正中切口分离双侧颈总动脉，穿线备用，用微动脉夹可逆性夹闭双侧颈总动脉5?min，共夹闭3次，每次间隔10?min，缝合伤口；假手术组仅暴露4条血管，不发生脑缺血，其余手术程序同上。造模大鼠术后7?d内死亡15只，存活27只，其中2只因术后出现偏瘫不能进行水迷宫测试而弃之不用，将实际存活的25只模型大鼠按雌雄和体质量随机分为电针组9只，西药组9只和模型组7只；假手术组死亡1只，存活7只。常规饲养、观察。
　　13治疗方法术后10?d，刀口完全愈合，饮食正常，无肢体残疾，体质量恢复后开始给予电针及西药尼莫通治疗。假手术组和模型组同等条件下饲养，未予任何治疗。电针组选用28号1寸毫针，于模型大鼠头部百会穴斜刺05寸，取背部双侧膈俞穴、脾俞穴和肾俞穴，各直刺05寸，以上穴位定位均参考《实验针灸学》［５］，连接电针仪，施以连续波，频率150?Hz，强度以大鼠安静耐受为度(约1?mA)，1次/d，留针20?min，连续治疗15?d。尼莫通组模型大鼠给予尼莫通(德国拜耳医药保健有限公司)12?mg/kg，溶解于蒸馏水中，按20?mL/kg灌胃，1次/d，连续15?d。
　　14检测方法
　　141行为学观测采用Morris水迷宫［6］学习记忆行为测试法。水迷宫内水深41?cm，水温22?℃～26?℃。在水池壁标明4个入水点，由此将水池等分为4个象限，任选一象限正中放置平台，没于水下1?cm，水面覆盖塑料泡沫，待电针及尼莫通治疗结束后(术后第26天)4组即开始水迷宫试验。实验包括：①定位航行试验，即将受试大鼠按顺时针方向依次由E、S、W、N?4个入水点顺序面向池壁放入水中，记录2?min内寻找平台的时间(逃避潜伏期，escape latency)。如果大鼠在2?min内找到平台，记录其实际逃避潜伏期；如果在2?min内未找到平台，由实验者将其引上平台并停留10?s，逃避潜伏期记录为2?min。历时6?d，每天1次。②空间探索试验(spatial probetest)，即定位航行试验结束后撤出平台，然后任选一相同入水点将大鼠放入水中，测其2?min内跨越原平台及其他3个象限相应平台位置的次数和大鼠在水迷宫外环停留的时间。
　　142血浆CO检测［7］以上4组大鼠均在水迷宫实验结束后(术后第32天)眼眶采血2?mL，立即离心分离血浆(3?000?r/min离心5?min)，-70?℃保存，30?d内测定。采用双波长分光光度法检测，在波长558?nm、566?nm处分别测吸光度，根据比尔定律求出碳氧血红蛋白(wCOHb)的量。
　　143大脑NO水平测定［8］将动物处死后，取大脑皮质缺血脑组织迅速置于冰盘上称质量，后置于匀浆机上用9?g/L生理盐水制成100?g/L的脑匀浆，4?℃下6?000?r/min离心10?min，取上清液采用硝酸还原酶法，在540?nm处测定吸光度，根据标准品计算出样品中NO的含量。
　　15统计方法采用SPSS?100 for Windows统计软件。不同组间水迷宫测试、血浆中CO含量、脑匀浆中NO含量的比较采用t检验，空间探索实验中各组大鼠跨越原平台及其他3个象限相应平台位置的次数采用单因素方差分析(Oneway ANOVA)，并以LSD法进行组间的两两比较。
　　2结果
　　21电针对大鼠学习巩固和再现能力的影响在Morris水迷宫实验中，与假手术组比较，模型组大鼠平均逃避潜伏期显著性延长(P＜001)。假手术组大鼠在原平台象限跨越相应平台次数明显多于其他3个象限，而模型组在原平台象限跨越相应平台次数与其他3个象限的跨越次数无显著性差异(P＞005)。将模型组和假手术组大鼠在原平台象限跨越相应平台次数做两两比较，模型组大鼠的跨越次数少于假手术组大鼠(P＜001)。说明模型组大鼠学习获取能力较差，血管性痴呆大鼠记忆力障碍模型造模成功。电针组和西药组大鼠的平均逃避潜伏期与模型组比较显著性缩短(P＜001)，相同时间内在原平台象限跨越相应平台次数显著性多于其他3个象限，跨越次数较模型组增多(P＜001)。表明电针和西药治疗均能改善模型大鼠的学习巩固和再现能力，且电针和西药的改善记忆力疗效无显著性差异。结果见表1、表2。
　　表1电针对模型大鼠逃避潜伏期的影响(±s)

　　表2电针对大鼠学习巩固和再现能力的影响(略)
　　表3电针对模型大鼠血浆COHb、脑组织NO含量的影响(略)
　　3讨论
　　血管性痴呆是发生在脑血管病基础上以记忆、认知功能缺损为主的获得性智能的持续性损害。中医认为其病位在脑，与心肝脾肾密切相关，病理性质为本虚标实。有研究表明［9］针刺对血管性痴呆具有显著治疗作用。百会位居巅顶，为三阳五会，取该穴可振奋人身之正气，醒脑开窍。背俞穴是脏腑之气输注于背腰部的输穴，不仅可以治疗与其相应的脏腑病症，也可以治疗与五脏相关的五官九窍、皮肉筋骨等病症。肾为先天之本，脾为后天之本，肾俞、脾俞合用可藏精生髓，化生血气以养脑；在精血亏虚基础上常常伴有瘀血阻滞经络，选取膈俞(血会)，既养血又活血，促进脑内瘀血消散。且膈俞、脾俞和肾俞还是膀胱经所属经穴，而“膀胱足太阳之脉，起于目内眦……其直者，从巅入络脑”，膀胱经可与脑相通。故诸穴合用，可养血生精、藏精生髓、填髓充脑、醒脑开窍，标本兼治，促进脑组织功能早日恢复。CO、NO是新型的神经递质，且在脑组织的不同区域，CO和NO分别调节环磷鸟苷(cGMP)水平［10-12］。缺氧缺血时，CO和NO在一定程度上改善了脑组织的缺氧缺血状态，对缺氧神经细胞具有保护作用。但CO、NO水平过度增加可发展至过度灌注［2］，与造成脑损伤密切相关；还可能对脑缺氧患者的神经功能恢复带来影响［1３-14］。并且CO和NO与脑病的严重程度密切相关，病情越重，CO和NO的含量越高［15］。本研究检测了VD模型大鼠血浆中CO和脑组织中NO的含量，其结果显示出相关性，与目前研究同组织中CO和NO含量变化相一致，表明电针能有效抑制血浆中CO和脑组织中NO的升高，显著性改善VD大鼠学习记忆能力，且提示CO、NO可能参与学习记忆过程。对于其机制，有研究［16］认为CO具有离子通道调节剂的作用，可通过调节Ca2+内流使钙依赖的神经元NOS和内皮细胞NOS活性增高，NO大量产生；另外，结合在血红蛋白上的NO能协同增加血红蛋白与CO的结合，经过一系列复杂的变化后，CO取代血红蛋白上的NO，释放出NO，过量NO导致神经细胞功能紊乱甚至死亡。因此，脑缺血缺氧时，作为神经递质，脑组织的NO和CO分子具有相关性，其调节功能相互影响。有研究证实，CO和NO均可作为一种神经信使参与长期增效(LTP)过程，在神经传递中起到了重要作用，但作用方式不同［17］。两者在LTP中均可作为逆行性信使，从突触后细胞传递到突触前末端。不同的是，CO提供广泛的基本水平刺激，而NO在LTP诱导中提供局部的适应性刺激［2］。电针治疗VD的具体机制，仍需要进一步研究。
【参考文献】
　　［1］Kannayiram Alagiakrishnan，Kamal Masaki．血管性痴呆［Ｊ］．国外医学·脑血管病分册，2004，12(11)：874．

　　［2］赖新生，黄泳．血管性痴呆的针灸治疗和实验研究近况［Ｊ］．广州中医药大学学报，2006，23(1)：81．

　　［3］张姝娟．内源性一氧化碳在神经系统中的作用［Ｊ］．国外医学·儿科学分册，2001，28(5)：264．

　　［4］赖新生，王黎，江雪华，等．电针对实验性血管性痴呆大鼠学习记忆及SOD和MDA的影响［Ｊ］．中国针灸，2000，8：497．

　　［5］李忠仁．实验针灸学［M］．北京：中国中医药出版社，2003：327．

　　［6］Morris R G，Garrud P，Rawlins J N，et al．Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions［Ｊ］．Nature，1982，297(5868):681．

　　［7］乐宏元，宋小兴，刘和平．一氧化碳血红蛋白双波长定量测量［Ｊ］．临床检验杂志，1996，14(2)：87．

　　［8］许能贵，易玮，赖新生，等．电针对局灶性脑缺血大鼠NO、NOS和ET1的影响［Ｊ］．广州中医药大学学报，2002，19(1)：63．

　　［9］王永炎，张伯礼．血管性痴呆现代中医临床与研究［M］．北京：人民卫生出版社，2003：45．

　　［10］朱清，萧明弟．一氧化氮——新的细胞信息［Ｊ］．国外医学·生理、病理科学分册，1994，14(4)：212．

　　［11］Lee R，Thomas A H，Pitts L L，et al.Spectrophotometric measurement of carboxyhemoglobin and methemoglobin in blood［Ｊ］．Clin Chem，1979，25(8):1388．

　　［12］Varma A，Hirsch D J，Glatt C E， et al．Carbon monoxide:a putative neural messenger［Ｊ］．Science，1993，259:381．

　　［13］Shi Y，Li H Q，Pan J，et al．Evidence of increased endogenous carbon monoxide production in newborn rat endotoxicasis［Ｊ］．Chin Med Sci J，1997，12(4):212．

　　［14］Shi Y，Feng Pang，Li Huaqiang，et al．Role of carbon monoxide and nitric oxide in newborn infants with postasphyxial hypoxicischemic encephalopathy［Ｊ］．Pediatrics，2000，106(60):1447．

　　［15］于露丹，焦立新，薛守祥，等．新生儿缺氧缺血性脑病与内源性一氧化碳、神经元烯醇化酶的关系［Ｊ］．中国医刊，2004，39(6)：354．

　　［16］Nathanson J A，Scavone C，Scanlon C．et al.The cellular Na pump as a site of action for carbon monoxide and glutamate:a mechanism for longterm modulation of cellular activity［Ｊ］.Neuron，1995，14(3):781．

　　［17］Zhuo M，Laitenen J T，Li X C，et al．On the respective roles of nitric oxide and carbon monoxide in longterm potenltiation in the hippocampus［Ｊ］．Learn Mem，1999，6(1):63．