摘要：【目的】探讨马兜铃经组织培养再生植株的条件。【方法】以马兜铃叶片作为外植体，以１／２MS、MS和改良MS培养基为基本培养基，在这些基本培养基上分别添加相应的植物激素而成为诱导马兜铃愈伤组织的培养基，观察：①3种基本培养基对诱导马兜铃愈伤组织的优劣；②不同pH值环境对诱导马兜铃愈伤组织的影响；③在相同的基本培养基中分别或同时加入不同种和不同量的植物激素(包括细胞分裂素KT或6BA和生长激素NAA)后，对诱导马兜铃愈伤组织的影响。【结果】①在3种基本培养基中加入相同的植物激素(01mg／L的KT和02mg／L的NAA)后 ，MS和改良MS培养基均能诱导大量的愈伤组织，而１／２MS培养基则未能诱导；②相同的培养基(改良MS培养基加入01mg／L的KT和02mg／L的NAA)分别置于pH=58、pH=70、pH=80的环境中时，后两者均能诱导大量的愈伤组织，而前者则只能诱导很少量的愈伤组织；③在相同的基本培养基(改良MS培养基)中分别单独加入细胞分裂素和单独加入生长激素，前者未见诱导出愈伤组织，而后者能诱导出来；将不同种和不同量的植物激素组成各种组合加入到相同的基本培养基(改良MS培养基)中，所形成的各种培养基对诱导马兜铃愈伤组织的影响观察显示，加入生长激素过多时，细胞分裂过快，导致愈伤组织松散而不利于芽的分化，加入过少时愈伤组织诱导率不高；最佳的培养基组合是在改良MS培养基中加入1mg／L KT、05mg/LNAA的培养基。【结论】以MS或改良MS为基本培养基，并在此基础上添加1mg/L的KT和05mg/L的NAA组成诱导愈伤组织的培养基，在pH=70～80的碱性环境下培养，是马兜铃经组织培养能较好地诱导愈伤组织的条件。
关键词：马兜铃； 中药培育
马兜铃为马兜铃科马兜铃属植物，它含一种具有肾毒性的物质马兜铃酸，同时这种物质也存在于许多有药用价值的植物中［１］。如果可以培育出不含马兜铃酸的新型植物，就可以发掘出马兜铃酸类中药的潜在药用价值，而更重要的是可将它作为改造其他有毒中药的模式系统。在基因工程中可以通过基因敲除等技术去除有毒成分的合成基因或改变代谢途径阻止有毒物质的合成［２］。马兜铃的组织培养获得再生植株这一技术为在马兜铃酸类植物中进行基因改造提供必要的技术支持。本文试图探讨马兜铃组织培养诱导愈伤组织的条件。
１ 材料与方法
１１ 植物 马兜铃(Aristolochia contorta Bunge)来源于广州中医药大学药圃。取马兜铃嫩叶先用香皂水浸泡去污5～7min，然后自来水冲洗干净；在超净工作台上，再用125mol/L的乙醇消毒30s，倒去乙醇，最后用005g/mL的升汞消毒10～18min，用无菌水冲洗8～10次。
１２ 植物激素 6糠氨基嘌呤(KT)为上海化学试剂公司产品；腺素(Ad)为上海丽珠东风生物技术有限公司产品；6苄氨基嘌呤(6BA)为新华活性材料研究所产品；α萘乙酸(NAA)为上海曹杨第二中学化工厂产品。
１３ 培养基［３］ 基本培养基分别为1/2MS、MS和改良MS培养基(其中蔗糖改为20g/L，ＮaＨ２ＰＯ４为170mg/L)，试验中根据具体要求在基本培养基中添加不同的植物激素，pH值为55～80。
１４ 培养 愈伤组织的诱导为暗培养，培养温度为(25±1)℃；根以及芽的分化为每天光照16h，光照强度为3000lx(勒克斯)，培养温度为(25±1)℃。
２ 结果
２１ 不同培养基对外植体诱导培养的影响 在1/2MS培养基、MS培养基和改良MS培养基中同时分别加入01mg/LKT和02mg/LNAA，结果显示在pH为75的环境下培养10d后，外植体在1/2MS培养基上未能诱导出愈伤组织，而在MS培养基和改良MS培养基上则能诱导出大量愈伤组织(见表1)。
２２ pH值对外植体诱导培养的影响 选用改良MS培养基加01mg/L的细胞分裂素KT和02mg/L的生长激素NAA，马兜铃在酸性环境下诱导出愈伤组织少，而在碱性环境下诱导出愈伤组织多、快(见表2)。
２３ 不同植物激素及其不同组合对外植体诱导培养的影响 在改良MS培养基中分别添加不同类型的植物激素，结果显示，单独添加细胞分裂素的培养基上(如6BA、KT、6BA+KT)未能长出愈伤组织，而在单独添加生长激素NAA或同时添加两种激素的培养基上均能长出愈伤组织。说明生长激素在诱导外植体愈伤组织时起着重要的作用。 转贴于 进一步观察在改良MS培养基中分别加入不同种类和不同量的细胞分裂素，结果显示当生长激素用量过多时，出现细胞分裂生长过快，使得愈伤组织变得松散而不利于芽的分化。细胞分裂素用量少时，愈伤组织的诱导率不高，而以在改良MS培养基中添加1mg/L的KT和05mg/L的NAA所诱导的愈伤组织最多(见表3和表4)。
２４ 不同激素组合对芽分化的影响 以改良MS培养基分别添加05mg/LKT+002mg/LNAA+2mg/LAd、05mg/LKT+01mg/LNAA+2mg/LAd、1mg/LKT+01mg/LNAA+2mg/LAd均可诱导60%分化芽，而添加1mg/LKT+002mg/LNAA+2mg/LAd时可诱导100%分化芽。结果表明：细胞分裂素KT用量低时，芽的分化效果不理想；生长素用量大时，对芽分化反而有抑制作用。而添加1mg/LKT+002mg/LNAA+2mg/LAd者芽分化效果较理想(见图1)。
２５ 不同激素组合对芽增殖的影响 将分化出的芽转移到芽增殖培养基中培养15d，在添加 002mg/LNAA、2mg/LAd的改良MS培养基中，当细胞分裂素KT的用量在03～1mg/L时，丛生芽的诱导率为80%～100%，其中以07mg/LKT的诱导率最高；在添加05mg/LNAA、2mg/LAd的改良MS培养基中，当KT用量在3～10mg/L时，丛生芽的诱导率为20%～40%，最大只有40%，长芽培养20d增殖情况见图2。以1／2MS培养基添加02mg/LNAA的芽生根培养情况见图3。表1 不同基本培养基对外植体诱导培养的影响表3 不同植物激素组合作用表4 加入不同量的KT和NAA培养
３ 讨论
本实验结果表明，以马兜铃嫩叶为外植体，诱导愈伤组织和丛生芽，基础培养基的选择以MS和改良MS培养基为好，在环境要求上pH＝70、pH＝80均可诱导较多的愈伤组织，而pH＝58只能诱导出少量，说明以碱性环境为好，与文献［３］认为培养植物材料大多数要求的碱性环境相似。本研究显示，在培养基中单纯添加细胞分裂素则未能诱导出愈伤组织，而单纯添加生长激素NAA则可诱导，说明在愈伤组织的诱导中，细胞生长素NAA起到很大的作用，主要是因为它能促进细胞生长、细胞分裂和诱导受伤的组织表面一至数层细胞恢复分裂能力。通常使用较高浓度的生长素，以诱导脱分化和促进愈伤组织生长［４］。本研究还显示在改良MS培养基基础上添加1mg/LKT和05mg/LNAA的培养基诱导效果最好。在诱导的第13天转到添加1mg/LKT+002mg/LNAA+2mg/LAd的培养基中，则5d后可分化出根状茎，再过5d即可由根状茎长出芽。在添加03～1mg/LKT、02mg/LNAA和2mg/LAd的培养基中，丛生芽的增殖效果最好。
参考文献
［１］杨瑞仪，曾庆平．马兜铃酪氨酸脱羧酶基因克隆、测序及同源性分析［Ｊ］．广州中医药大学学报，2005，22(2)：152．
［２］冯丽玲，曾庆平．青蒿鲨烯合酶基因及其cDNA的克隆与测序［Ｊ］．广州中医药大学学报，2004，21(5)：387
［３］李浚明．植物组织培养教程［Ｍ］．北京：中国农业大学出版社，1996：41．
［４］谭文澄，戴策刚．观赏植物组织培养技术［Ｍ］．中国林业出版社，1991：61，70，116．转贴于