摘要：【目的】构建铁皮石斛互补脱氧核糖核酸(cDNA)表达文库，为克隆石斛活性成分生物合成相关功能基因的全长奠定基础。【方法】以Trizol一步法从4年生的铁皮石斛中提取总RNA，分离纯化mRNA，LD_PCR(long distance polymerase chain reaction)法反转录合成双链cDNA，以λTripIEX2为载体，构建铁皮石斛cDNA文库，文库滴度以每mL含噬菌斑形成单位(pfu)的数目来表示，PCR扩增鉴定插入片段。【结果】成功地构建了铁皮石斛cDNA表达文库，原始文库的噬菌斑滴度为43×105?pfu/mL，总克隆数为31×105，重组率为976%，扩增后文库总滴度为68×109?pfu/mL，对随机挑取的噬菌斑进行PCR鉴定，结果插入片段多分布在05～20?kb之间，绝大部分在12～17?kb左右。【结论】文库质量鉴定结果表明，所构建的铁皮石斛cDNA文库具有较好的库容量、较高的重组率以及较大的插入片段。
关键词：铁皮石斛/化学； 石斛碱/生物合成； 基因文库
中药功能基因的研究逐渐成为中药现代化研究的一个热点，因为功能基因和次生代谢酶基因决定了有效成分的结构与功能，是中药现代化的关键环节之一［１］。在植物中药功能基因研究中，与基因组测序和表达序列标记(expressed sequence tag，ESTs)测序相比，药用活性成分生物合成相关基因的研究更受到重视，克隆基因的数量呈上升趋势，预示着天然产物后基因组时代的开启及一些天然产物生产方式的可能变革。人们期望克隆中药有效成分的功能基因，并通过基因工程与化学的有机结合而形成新的基因药物。
石斛为名贵中药材，具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳、明目强身等功效。石斛碱是石斛药材中最重要的活性成分之一，也是最早从石斛中分离出来的化合物［2-3］，为分离、克隆石斛碱相关功能基因，本文构建了铁皮石斛互补脱氧核糖核酸(cDNA)表达文库，为克隆全长石斛碱生物合成相关功能基因并进行功能鉴定奠定基础。
1 材料与方法
11 材料 供试铁皮石斛采自云南大理，由中国科学院华南植物研究所叶秀嶙研究员提供，保种于本实验室。
12 主要试剂与仪器 Trizol试剂酶购自Gibco公司；信使核糖核酸(mRNA)分离纯化试剂盒购自Promega公司；cDNA文库试剂盒购自Clontech公司；Sfi I购自Biolabs公司；焦碳酸二乙脂(DEPC)购自上海生工公司(Amresco分装)；其他常规生化试剂均为分析纯。紫外分光光度计为Pharmacia公司的Genequant;聚合酶链反应(PCR)仪为Peking Elemer公司的GeneAmp SYSTEMS?9600。
13 总核糖核酸(RNA)提取及mRNA纯化 取4年生新鲜的铁皮石斛，称取其叶片100?mg，经清洗及用体积分数为75%的乙醇消毒后，置研钵中加液氮迅速充分研磨，加2?mL Trizol试剂，余下操作按试剂盒说明进行；提取的总RNA用12?g/L的甲醛琼脂糖变性凝胶电泳分析并鉴定其质量，用100?μL DEPC水溶解储于-80℃的超低温冰箱中备用；取10?μL RNA用DEPC水稀释50倍后，采用分光光度计测量260?nm/280?nm处的吸光度(D)，计算总RNA的得率，计算公式为：ρRNA=004×稀释倍数×D260 采用亲和素顺磁珠(SAPMPS)法从总RNA中分离纯化mRNA。在无RNA酶(RNaesfree)的Eppendorf管中加入01?mg的总RNA和无RNA酶的水至终体积为500?μL，65℃加热10?min，加入3?μL生物素标记的高聚脱氧胸苷酸［Oligo(dT)］和13?μL?20倍的SSC缓冲液于RNA中，其余步骤按说明书及文献［4-5］方法进行。
14 cDNA的合成及文库的构建 采用Long DistancePCR(polymerase chain reaction)法合成cDNA的第1和第2链［4-7］。在05?mL离心管中，加入3?μL铁皮石斛mRNA，按试剂盒方法加入相应试剂及引物，经反转录酶合成第1链cDNA；在1个05?mL的离心管中加入2?μL第1链cDNA，其余试剂按试剂盒要求加入，放入经预热到95℃的PCR仪中。PCR反应程序如下：94℃变性30?s，接着94℃、5?s，68℃、6?min，共26个循环；PCR结束后，取5?μL采用11?g/L琼脂糖凝胶电泳检测。合成的cDNA经蛋白酶K处理去除蛋白质，经氯仿/异戊醇抽提，酒精沉淀后，用限制性内切酶Sfi I酶切消化，过CHROMA Spin400柱分离纯化，除去分子量小于400?bp的cDNA片段和杂质。
将分离的双链cDNA片段按一定浓度与定向克隆到Sfi I酶切的去磷酸化的TripIEX2噬菌体连接，cDNA按浓度梯度设计3个连接反应，cDNA的用量分别为05?μL、10?μL、15?μL；并将连接产物用噬菌体包装蛋白进行包装构成cDNA原始文库，以XL1_Blue为受体扩增文库后，用噬菌体缓冲液收集于4℃保存。
15 cDNA文库质量鉴定
151 滴度测定 用噬菌体缓冲液分别将原始和已扩增的cDNA文库稀释不同倍数，加入100?μL的XL1_Blue受体菌及100?μL稀释液，37℃吸附15?min；然后混合2?mL溶化的LB/MgSO4顶层软琼脂(48℃左右)，迅速混匀到预热至37℃的平板，快速摇动平板使顶层软琼脂分布均匀，顶层软琼脂凝固后，37℃倒置培养过夜，每隔2?h检查噬菌斑生长情况。每2?mL的顶层软琼脂加50?μL?5溴4氯3吲哚βD半乳糖苷(XGal，20?g/L)、50?μL异丙基硫代βD半乳糖(IPTG，20?g/L)，计数噬菌斑形成单位(plague forming unit，pfu)，按下列公式计算文库滴度：npfu/(个・mL-1)=(N噬菌斑×稀释倍数)/V受体菌152 文库重组率的测定 采用蓝白斑互选法测定重组率［8-11］，利用XGal显色原理，在测定滴度时加入100?mmol/L的IPTG及XGal，过夜培养，通过篮、白斑的数量计算文库重组率。
153 cDNA插入片段的PCR快速鉴定 采用λTripIEX2噬菌体5’ PCR?primer和3’ PCR?primer引物分别对构建的文库进行PCR扩增，检查插入片段的长度；从LB平板上随机挑取13个独立的噬菌斑，分别加到含有200?μL噬菌体缓冲液的Eppendorf管中，37℃放置1?h后，保存于4℃；在PCR管中加入3?μL?10倍的PCR缓冲液、24?μL 2?mmol/L脱氧核苷酸混合物(dNTP)、24?μL 25?mmol/L MgCL2、1?μL?Tap酶、λTripIEX2上下游测序引物各10?pmol/L，加去离子水使总体积达30?μL。PCR反应条件为95℃预变性4?min，95℃变性30?s，55℃退火45?s，72℃延伸1?min，36个循环，最后72℃延伸10?min，反应在PTC?220型PCR仪上进行，11?g/L?的琼脂糖凝胶电泳检测分析。
2 结果
21 总RNA及mRNA的质量 提取的总RNA经分光光度计测定，测得mRNA的D260nm平均吸收值为023，平均得率为046?g/L，D260nm/D280nm=19，无DNA、蛋白质及小分子污染。提取的总RNA经12?g/L的甲醛琼脂糖变性凝胶电泳检测，出现非常清晰的28s?RNA(s为沉降系数)和18s?RNA两条带(图1)，表明所提取的RNA基本上没有降解；加样孔处没有亮带，说明没有DNA和小分子物质的污染；mRNA分离纯化后电泳呈弥散状，也证明了总RNA的完整性，说明提取的RNA质量很高，符合建库要求。
22 cDNA的合成及分析 用LDPCR法合成cDNA第1和第2链之后，经11?g/L的琼脂糖凝胶电泳检测，整个条带呈弥散状，结果显示合成的cDNA基本分布在05～9?kb之间(图2)，中间有几条与组织特异性高丰度mRNA相对应的亮带，说明纯化的mRNA所合成的cDNA较为完整、质量较好，合成的双链cDNA是成功的，符合建库要求。 23 文库的滴度、重组率及插入片断大小分析 将包装产物稀释后进行原始文库的滴度检测，结果表明原始文库的滴度为43×105?pfu/mL，总克隆数为31×105个；扩增文库的滴度为68×109pfu/mL。通过XGal显色原理测定重组率，计算蓝斑及白斑的数量，得到文库的重组率为976%。从LB平板上随机挑取13个噬菌斑的PCR鉴定，结果插入片段多分布在05～20?kb之间，绝大部分在12～17?kb左右(图3)。
3 讨论
构建高质量的cDNA文库，是高效筛选目的基因的关键。而其前提是提取并分离出高质量的mRNA，因此提取纯度高、完整性好的mRNA就成为cDNA文库构建的核心步骤，直接关系到文库的建立和文库的质量。植物组织中的RNA含量较低，而且离体植物组织的RNA降解速度很快，因此，铁皮石斛叶片采下后应迅速用液氮冷冻，然后放置-70℃中保存，以保证RNA不被降解。在提取过程中严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性，是实验成败的关键。铁皮石斛RNA提取和mRNA分离的方法与其他植物的方法基本相同，但由于铁皮石斛多糖含量较高，我们采用十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)法去除多糖，结合LiCl分离DNA和RNA，加强了RNA的纯化过程，取得了很好的效果，获得了高质量的总RNA；采用磁珠法分离mRNA，简单、快速、方便，得到了纯净的mRNA。
文库的滴度、重组率及插入片段的大小是鉴定cDNA文库质量的重要指标。本文运用了LD_PCR法合成cDNA，使得低丰度的基因表达序列在文库中得到了富集，便于稀有mRNA的扩增和克隆。一般来说，文库的滴度达到105pfu/mL以上即为有效的文库［12］。我们构建的cDNA文库的滴度为43×105pfu/mL，符合这一要求，文库的重组率为976%，说明文库是完整的、有效的，并且质量较高。另外，我们选用容易质粒化的λTripIEX2为cDNA的克隆载体，λTripIEX2具有多方面的优点，它可以通过插入亚克隆而转至质粒载体或其他表达载体，每一个插入λTripIEX2载体的多克隆位点(MCS)部位的cDNA均可通过全部3个阅读框架进行表达；且构建的文库滴度高，为应用快速末端扩增法(rapid amplification of cDNA ends，RACE)克隆全长石斛碱生物合成相关功能基因奠定了基础。
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