木犀草素的体外抗炎机制分析

【摘要】 【目的】观察木犀草素对脂多糖(LPS)诱导的RAW2647细胞(小鼠单核/巨噬细胞系)核因子κB(NFκB)和环氧合酶2(COX2)表达及NFκB?DNA结合活性的影响，探讨其体外抗炎机制。【方法】以RAW2647细胞为研究对象，选用对数生长期的细胞，分别设空白对照组，脂多糖(LPS)处理组(模型组)，5、15、45?μmol/L木犀草素处理组(中药低、中、高剂量组)；加入药物30?min后再加入终浓度为1?μg/mL的LPS继续培养12?h，分别采用酶免疫测定法（EIA）检测木犀草素对RAW2647细胞前列腺素E２(PGE2）生成的影响；电泳迁移率变动分析法(EMSA)检测NFκB的DNA结合活性；逆转录聚合酶链反应（RTPCR）测定RAW2647细胞中COX2 mRNA的水平；Western blot法测定RAW2647细胞中NFκB和COX2蛋白的表达。【结果】木犀草素能显著性抑制LPS诱导的RAW2647细胞PGE2的生成，降低NFκB的DNA结合活性；下调LPS诱导的RAW2647细胞COX2?mRNA、NFκB和COX2蛋白的表达。【结论】木犀草素的抗炎作用可能与其能抑制核内NFκB的表达和DNA结合活性从而下调COX2的表达有关。
【关键词】 木犀草素/药理学；炎症/中药疗法；信号传导；基因表达调控；细胞培养
　　
　　【Objective】To investigate the invitro antiinflammatory mechanism of luteolin by observing the effect of luteolin on nuclear factorkappa B (NFκB) and COX2 expression as well as DNAbinding activity of NFκB in RAW2647 cells activated by lipopolysaccharides (LPS).
　　
　　【Methods】RAW2647 cells at logarithmic growth phase were allocated to blank control group， model group (treated with LPS) and luteolin groups (treated with 5， 15， and 45 μmol/L luteolin respectively). After being treated with luteolin for 30 min and then incubated with 1μg/mL LPS for 12 hours， the change of prostaglandin E2 (PGE２) level was observed by enzyme immunoassay (EIA)， DNAbinding activity of NFκB was detected by electrophoretic mobility shift assay (EMSA)， mRNA expression of COX2 was examined by reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR)， and NFκB and COX2 protein expression in RAW2647 cells was analysed by Western blotting.
　　
　　【Results】Luteolin obviously inhibited the formation of PGE２， decreased DNAbinding activity of NFκB and downregulated mRNA expression of COX2 as well as NFκB and COX2 protein expression in RAW2647 cells activated by LPS.
　　
　　【Conclusion】The antiinflammatory mechanism of luteolin may be related with the downregulation of COX2 expression by inhibiting the expression of NFκB and DNAbinding activity.
　　Key words:LUTEOLIN/pharmacology;INFLAMMATION/TCD therapy;SIGNAL TRANSDUCTION；GENE EXPRESSION REGULATION；CELL CULTURE
　　木犀草素(Luteolin)属于黄酮类化合物，主要存在于菊花、忍冬花、紫苏叶等天然药物中，研究表明木犀草素具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、免疫调节等多种作用［1-3］，木犀草素的抗炎作用与其抑制炎症介质的释放和核因子κB（NFκB）介导的基因表达有关［３-４］。本文观察了木犀草素对脂多糖(LPS)诱导的RAW2647细胞NFκB表达、DNA结合活性以及对环氧合酶2(COX2)表达的影响，以进一步探讨木犀草素抗炎的作用机理。
　　1材料与方法
　　11药品及试剂木犀草素（纯度＞98%）和前列腺素E2酶免疫分析试剂盒（PGE2 EIA Kit）均为美国Cayman公司产品；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、二甲基亚砜（DMSO）、焦碳酸乙二酯（DEPC）等为Sigma公司产品；RPMI1640为Gibco公司产品；超级小牛血清为杭州四季青生物工程公司产品；总RNA提取试剂（Trizol）为Invitrogen公司产品；逆转录聚合酶链反应（RTPCR）一步法试剂盒为宝生物（大连）工程有限公司产品；100?bp?DNA?marker、N，N，N，N四甲基乙二胺（TEMED）、6倍上样缓冲液均为华美生物工程公司产品；增强化学发光（ECL）试剂、抑酞酶（Aprotinin）均购于上海华舜生物工程有限公司；βactin山羊IgG多克隆抗体、NFκB小鼠IgG单克隆抗体和COX2山羊IgG多克隆抗体均为北京中山公司产品；聚偏(二)氟乙烯（PVDF）膜为美国Pall Gelman公司产品；NFκB寡核苷酸链为上海生物工程公司产品；γ32P标记三磷酸腺苷（［γ32P］ATP）为北京亚辉生物工程公司产品；T4噬菌体多核苷酸激酶为Promega公司产品。
　　12方法
　　121细胞培养RAW2647细胞(小鼠单核/巨噬细胞系)购自上海细胞研究所，在37?℃、体积分数为5%CO2条件下，用含体积分数为10%小牛血清、青霉素(1×105?U/L)及链霉素(100?mg/L)的RPMI1640培养液传代培养。
　　122PGE2含量测定将对数生长期的RAW2647细胞接种于6孔培养板中，设空白对照组，脂多糖（LPS）处理组（模型组），5、15、45?μmol/L木犀草素处理组（中药低、中、高剂量组）；药物加入30?min后再加入终浓度为1?μg/mL的LPS，继续培养12?h；收集细胞培养液，以PGE2 EIA Kit测定其中的PGE2浓度，每组重复3次。
　　123电泳迁移率变动分析(EMSA)细胞培养及分组同122。细胞核蛋白的提取：细胞以冷磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2次后加入100?μL缓冲液A［10?mmol/L?N2羟基哌嗪N2乙磺酸（HEPES）-KOH、15?mmol/L?MgCl2、10?mmol/L?KCl、1?mmol/L?苯甲基磺酰氟（PMSF）、10?mg/L?Leupeptin、35?mg/L抑酞酶（Aprotinin）、1?mmol/L 二硫苏糖醇（DTT）］，冰上放置15?min，再加体积分数为10%壬基酚聚氧乙烯醚（NP40）10?μL，振荡混匀；然后10?000?g、4?℃、离心10?min；于沉淀中加100?μL缓冲液B［20?mmol/L?HEPESKOH、27?mol/L?甘油（Glycerol）、420?mmol/L NaCl、15?mmol/L?MgCl2、1?mmol/L?PMSF、1?mg/L?Leupeptin、10?mg/L?Aprotinin、1?mmol/L?DTT］，冰浴30?min，离心取上清液，考马斯亮蓝法测定核蛋白浓度后，－70?℃保存。广州中医药大学学报2007年第24卷第3期张毅，等.木犀草素的体外抗炎机制研究双链寡核苷酸探针的标记：含有NFκB特异性识别位点的双链脱氧寡核苷酸序列如下:5AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC3；3TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG5。依次加入寡核苷酸探针(10?pmol /μL)10?μL、10倍T4多核苷酸激酶缓冲液2?μL、T4多核苷酸激酶(10?U /μL)10?μL、［γ32P］-ATP (10?μCi/μL)25?μL、无核酸酶水135?μL，共20?μL。反应混合液于37℃孵育10?min，加入05?mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)1?μL终止反应。乙醇沉淀法去除未结合标记物。 取10?μg核蛋白与放射性核素标记的DNA探针在室温进行结合反应30?min，总体积为10?μL。DNA蛋白复合物经40?g/L的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压110?V，电泳60?min。真空负压加热干燥凝胶后，－70?℃放射自显影，显影后扫描至计算机。用Bandscan 43图像分析软件进行光密度积分值分析。每个图像均重复分析3次，取平均值。
　　124RTPCR测RAW2647细胞中COX2?mRNA的表达RAW2647细胞分组及处理同122。收集细胞，用Trizol试剂提取细胞的总RNA，按一步法试剂盒步骤进行RTPCR。COX2引物为：上游5GGGAAGCCTTCTCCAACC3，下游5GAACCCAGGTCCTCGCTT3，产物长度为245?bp；βactin引物为：上游5 CCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGAC3，下游5 AGGGTACATGGTGGTGCCGCCAGAC3，产物长度为587?bp。COX2的反应条件为：50?℃逆转录30?min；94?℃预变性2?min；94?℃变性45?s，56?℃复性1?min，72?℃延伸1?min，扩增30个循环；72℃延伸10?min。PCR产物以15?g/L琼脂糖凝胶电泳，Doc Gel 1000成像系统观察结果并拍照。同时进行光密度积分值分析，以COX2 PCR产物与内参照βactin PCR产物的光密度积分值之比作为COX2 mRNA的相对含量值。
　　125Western blot测RAW2647细胞中COX2和NFκB蛋白的表达 细胞处理同122，细胞裂解液裂解细胞后提取总蛋白，考马斯亮蓝法测定样品总蛋白含量。每组各取50?μg蛋白质样品加上样缓冲液煮沸变性后，进行100?g/L十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)；电转移至PVDF膜；用含50?g/L脱脂奶粉的Tris缓冲盐溶液(TBS，pH?80)封闭2?h；分别加入适量COX2、NFκB和βactin多克隆抗体，摇床上室温反应2?h；洗膜3次，加辣根过氧化物酶标记的二抗，室温反应2?h；洗膜后作ECL化学发光，X片曝光显影。图像经扫描仪扫描后，用图像分析软件BandScan 43进行光密度积分值分析，以目的蛋白与内参照βactin蛋白表达量的光密度积分值之比作为目的蛋白表达量的相对含量值。
　　13统计学处理采用SPSS?110统计软件进行。
　　 2结果
　　21木犀草素对RAW2647细胞中LPS诱导PGE2生成的影响表1结果显示，空白对照组RAW2647细胞中PGE2生成很低，当加入诱导剂LPS后，PGE2的生成显著性增加，而15、45?μmol/L木犀草素组中的PGE2生成显著性下降，表明中、高剂量的木犀草素可显著性抑制PGE2的生成。

转贴于 　　表1木犀草素对RAW2647细胞中LPS诱导PGE２生成的影响　略
　　22木犀草素对RAW2647细胞中NFκB的DNA结合活性的影响由图1可见，空白对照组RAW2647细胞核蛋白中仅有少量NFκB与特异性寡核苷酸探针结合；而模型组细胞内NFκB活性明显高于空白对照组， 低、高剂量的木犀草素明显抑制了NFκB的DNA结合活性。
　　23木犀草素对RAW2647细胞COX2?mRNA表达的影响图2结果表明，空白对照组中RAW2647细胞COX2?mRNA的基础表达很低， 而LPS可以明显上调RAW2647细胞COX2?mRNA的表达量，加入浓度为15、45?μmol/L的木犀草素后，COX2?mRNA的表达均明显下降，表明中、高剂量的木犀草素可显著性抑制COX2?mRNA表达。
　　24木犀草素对LPS诱导的RAW2647细胞中NFκB和COX2蛋白表达的影响Western blot结果显示，终浓度为1?mg/L?LPS处理细胞后，NFκB和COX2蛋白条带明显变粗，木犀草素处理组NFκB和COX2的蛋白表达量经图像分析结果显示：15、45?μmol/L木犀草素处理组分别与模型组比较，NFκB和COX2蛋白表达均明显降低，表明中、高剂量的木犀草素可显著性抑制NFκB和COX2蛋白表达（图3）。
　　3讨论
　　图1木犀草素对RAW2647细胞中NFκB的DNA结合活性的影响　略
　　录因子，涉及免疫和炎症反应的快速早期基因激活和信号转导，具有和某些基因启动子区的特定核苷酸序列结合而启动基因转录的功能［5］。典型的NFκB是由p50和p65组成的异二聚体，它与抑制性蛋白IκB结合而为非活性状态，IκB通过锚蛋白重复序列和NFκB的Rel同源结构域相互作用，遮盖了NFκB上的核定位序列，从而使NFκB滞留于胞质。NFκB可以被许多刺激剂如细胞因子、氧化剂、病毒氧化剂、病毒激活，被激活的NFκB与IκB解离，转入核内与靶基因的特异位点结合，调控基因转录［6-7］。研究表明［8］，COX2启动子上含有NFκB 位点序列，NFκB是启动COX2转录激活的重要转录因子。LPS可激活巨噬细胞，诱导COX2的高表达， LPS首先与细胞表面的脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide binding protein， LBP)结合，LBP将LPS运送到巨噬细胞膜上与CD14结合，从而激活胞内PKA和（或）PKC和（或）MAPK信号传导M.DNA分子量标准；
　　图2木犀草素对RAW2647细胞COX2 mRNA表达的影响　略
　　图3木犀草素对LPS诱导的RAW2647细胞中NFκB和COX2蛋白表达的影响　略
　　通路，最终引起IκB的磷酸化和降解，使NFκB从NFκBIκBs复合物解离并活化，激活的NFκB转位到细胞核内与COX2基因上NFκB位点序列结合，启动COX2的转录过程，导致COX2高表达［9］，从而产生大量的PGE２。PGE２是一种重要的炎症介质，介导炎症反应中疼痛和发热的产生。本研究结果表明：浓度为15、45?μmol/L的木犀草素能显著性抑制LPS诱导的PGE２生成，并下调LPS诱导的COX2?mRNA和蛋白表达，提示木犀草素通过降低COX2?mRNA表达，使COX2蛋白生成减少，从而抑制COX2介导的PGE２生成。结果还发现木犀草素可显著性抑制NFκB的蛋白表达及其DNA结合活性，表明木犀草素除了通过下调NFκB表达，还可能通过影响其他与NFκB?DNA结合活性密切相关的因素，最终抑制NFκB的DNA结合活性。研究结果提示木犀草素的抗炎作用与其抑制COX2表达和PGE２的生成有关。而木犀草素对COX2表达的抑制作用则可能与其抑制NFκB的表达，降低NFκB?DNA结合活性密切相关，这可能是木犀草素抗炎的主要作用机制之一。
【

参考文献

】
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