【摘要】 【目的】观察纳子法电针治疗对哮喘模型豚鼠嗜酸性粒细胞（Eos）凋亡的影响。【方法】将４８只豚鼠随机分为４组：申时（１５：００～１７：００）电针组、巳时（９：００～１１：００）电针组、模型组及正常对照组；除正常对照组外，其他组均采用鸡卵清蛋白复制哮喘模型，治疗组分别于不同时段取定喘、肺俞、经渠穴电针治疗；采用苏木素—伊红（ＨＥ）染色法和脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记（ＴUＮＥＬ）法，检测Eos计数及肺组织中Eos凋亡率。【结果】模型组Eos计数显著性升高（Ｐ＜０.００１），Eos凋亡率无显著性变化；申时电针组和巳时电针组Eos计数均显著性降低（Ｐ＜０.００１），Eos凋亡率均显著性升高（Ｐ＜０.００１），其中申时电针组２项指标优于已时电针组（Ｐ＜０.０５或Ｐ＜０.００１）。【结论】按时辰取穴的纳子法电针治疗哮喘的疗效优于不按时辰治疗者，其机制可能与降低模型豚鼠气道的Eos计数与凋亡率有关。
【关键词】 哮喘／针灸疗法； 纳子法； 肺组织／病理学； 细胞凋亡； 疾病模型，动物； 豚鼠
目前哮喘的发病率和死亡率呈逐年上升态势，如何更有效地治疗哮喘成为全球医学界的一大难题。中医学采用针灸手段治疗哮喘疗效确切［１］，其中纳子法是中医时间医学代表的一种经典针灸方法，强调不同时辰脏腑气血盛衰状况不同，针灸效应亦不同。有学者［2］认为子午流注纳子法的优越性就在于强调选择针灸时间的同时亦强调选取适当穴位， 从而最大限度地发挥穴位的效应。但目前尚未见运用纳子法电针治疗哮喘的相关报道。本实验观察纳子法电针治疗对哮喘模型豚鼠的治疗效果，以进一步明确其治疗机制，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 动物及分组 健康豚鼠48只（由中山大学实验动物中心提供，编号0018507） ，体质量350～400g，雌雄各半，随机分为4组： 申时电针组（A组）、巳时电针组（B组）、模型组（C组）和正常对照组（D组），每组12只。
1.2 主要试剂与仪器 鸡卵清蛋白（Sigma 产品，批号：A5503）；多聚甲醛（天津百世化工，批号：915）；脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记（TUNEL）试剂（Chemicongoncan公司产品，批号：S7100）；电针机（SLT-B型全信息电针治疗机）；超声雾化器（粤华WH-2000，粤汕）；定量分析生物显微图像光学处理系统（南方医科大学病理教研室提供）。
1.3 模型复制［3］ A、B、C 3组动物均以100g/L鸡卵清蛋白液1mL腹腔注射致敏。致敏后第7天将3组动物置特制激发箱内，以10g/L鸡卵清蛋白溶液喷雾激发，按个体差异每次 2～10min ， 直至“哮喘”发作（点头呼吸） ， 连续5d。正常对照组以等容积生理盐水代替。
1.4 纳子法电针治疗 造模成功后Ａ组于肺经昼夜气血盛衰的峰值申时（15：00～17：00），Ｂ组于肺经昼夜气血盛衰的非峰非谷值巳时（9：00～11：00），取定喘、肺俞、经渠穴电针治疗（取穴方法参照《实验针灸学》［4］）。每次治疗10～15min，1次/d，6d为１疗程，共治疗2个疗程。
1.5 病理学检查 末次喷雾激发后第2天，各组动物麻醉后取出右肺，标本用100g/L多聚甲醛固定，从固定部位切取右肺组织块。
1.6 肺组织中嗜酸性粒细胞（Eos）计数及Eos凋亡率测定 切片分别做常规苏木素—伊红（HE）染色和TUNEL标记。原位凋亡标记方法参考试剂盒说明及文献［5］。凋亡阳性细胞核呈棕黄或棕褐色，与同一来源的组织HE染色对照，鉴别为Eos。细胞计数方法为在显微镜下每张切片分别连续数10个高倍视野（×400）的Eos （HE染色）和凋亡Eos （TUNEL原位凋亡标记）总数，计算凋亡细胞所占相应细胞的百分比即为Eos凋亡率。
1.7 统计学处理 采用SPSS 11.0进行多个样本均数间两两比较的q检验。
2 结果
2.1 HE染色法观察 图1结果显示，肺组织切片正常对照组支气管及肺泡结构正常，几乎没有Eos。模型组的细、小支气管管壁和伴行动脉周围有较多的Eos、浆细胞和淋巴细胞浸润，同时可见支气管黏膜皱壁增多、基底膜增厚、平滑肌增生、管腔缩窄或被黏液栓和炎性细胞闭塞等现象。两治疗组炎性改变不及模型组的变化明显。巳时治疗组的肺泡发现有中量的Eos、浆细胞和淋巴细胞浸润的炎症渗出，较少发现有明显的支气管基底膜增厚、平滑肌增生、管腔狭窄、或者被黏液栓和炎症细胞闭塞等现象。而申时治疗组只有少量到中量的炎症渗出，肺泡结构较为清晰，未发现有明显的支气管基底膜增厚、管腔狭窄或者被黏液栓和炎症细胞闭塞等现象。
2.2 TUNEL染色法观察 图2结果显示，两治疗组中Eos的TUNEL阳性细胞数相对增多；模型组Eos的数量较多，其TUNEL阳性细胞却少见；正常对照组Eos的数量较少，其TUNEL阳性细胞亦少见。表１结果显示，申时电针组与巳时电针组均可显著降低Eos计数，升高Eos凋亡率（Ｐ＜０.００１），且申时电针组２项指标与巳时电针组比较均有显著性差异（Ｐ＜０.０５或Ｐ＜０.００１）。
表1 各组豚鼠肺组织中Eos计数及Eos凋亡率比较（略）
Table 1 Comparison of lung EOS count and EOS apoptotic rate in various groups
统计方法：q 检验；①Ｐ＜０.００１，与正常对照组比较；②Ｐ＜０.００１，与模型组比较；③Ｐ＜０.０５，④Ｐ＜０.００１，与巳时电针组比较
a.正常对照组b．模型组c.巳时治疗组d.申时治疗组
图1 各组光镜下豚鼠肺组织形态比较（ＨＥ染色，×400）（略）
Figure 1 Features of guinea pig lung tissue under light microscope （HE stain，×400）
a.正常对照组b．模型组c.巳时治疗组d.申时治疗组
图2 各组豚鼠肺组织变化比较（ＴＵＮＥL染色，×400倍）（略）
Figure 2 Features of guinea pig lung tissue under light microscope（TUNEL stain，×400）
3 讨论
本实验选用鸡卵清蛋白溶液腹腔注射并喷雾法复制哮喘模型，该方法操作简易、成功率高、可重复性强，已在实验研究中得到广泛应用［6］。
在观察指标选择上，Eos是目前得到公认的哮喘气道炎症的主要效应细胞［7］，因此，如能使浸润于肺组织中的Eos消散，对哮喘症状的改善极为有利。哮喘气道中的Eos可能有5种减少的途径：进入气道组织的Eos数目减少；气道组织内原有的Eos大量转移、分布到其他器官；Eos坏死性死亡；Eos凋亡；Eos进入气道腔，排出体外。在上述方式中，目前认为最为可能的是Eos的凋亡［8-9］。陈金等［10］研究证明哮喘与嗜酸性粒细胞凋亡有关。与其他细胞凋亡检测方法相比，本实验所采用的TUNEL染色法是一种较为敏感和准确的方法，并可对凋亡细胞进行定量分析。但是在肺组织中确定凋亡细胞为嗜酸性粒细胞存在着一定难度，我们首先在TUNEL片上找到细胞核呈棕黄或棕褐色细胞的凋亡细胞，然后将与之对应的HE片进行鉴别。但是由于石蜡切片有一定的厚度，有时HE片和TUNEL片不能一 一对应，存在着一定困难，如何提高这方面的鉴别水平有待进一步的研究。 在治疗方法选择上，针灸作为一种污染少的自然疗法治疗哮喘发挥了一定的优势，运用纳子法电针治疗哮喘更具优越性。中医学强调“人与天地相参也，与日月相应也”，即天之阴阳随时间递相变化，势必引起人体阴阳随时间发生相应改变，故人体十二经脉内应脏腑，外应十二时辰，昼夜十二时辰经脉气血盛衰变化有其节律。“当气血流注某经所属时辰时，该经气血旺，脏气盛，穴位开，表现为该经的腧穴，该经所属的脏腑功能增强、兴奋，对治疗的敏感性增高”［11］。而“每一经盛时为24h出现1次，所以其衰时则在盛时之后12h之时，衰后12h又值当盛之时”［12］。
在取穴择时上，按纳子法原则“虚则补其母， 实则泻其子， 不虚不实取本经本穴”原则选取手太阴肺经本穴经渠，同时选用与肺密切相关的定喘、肺俞2穴。此2穴是针灸临床用以治疗肺系疾病的常用有效穴位，可起到调整肺功能、增强肺抵抗力以及促进病愈之功效［13］。基于此，根据纳子法理论，本实验选择肺经昼夜气血盛衰的峰值时辰申时与非峰非谷值时辰巳时 ，对哮喘模型豚鼠分别采用电针定喘、肺俞、经渠3穴治疗，以观察择时治疗的效应。本实验结果显示，哮喘模型豚鼠经电针定喘、肺俞、经渠穴治疗后，Eos计数值降低，Eos凋亡率上升，与模型组比较有显著性差异（Ｐ＜０.０５或Ｐ＜０.００１），说明针灸定喘、肺俞、经渠穴有降低气道局部的Eos计数、提高哮喘模型豚鼠气道周围Eos凋亡率的作用，且申时施治，即肺经气血旺盛时有良好疗效，证实了是否择时治疗之间具有显著性差异，揭示时辰与一定的穴位配伍可产生协同作用，而且子午流注纳子法的时辰—穴位配伍具有优越性， 为提高临床疗效提供了实验依据。同时也证实了传统纳子法的基本合理内核，即不同时辰机体气血盛衰状态不同，其针灸效应也不相同，提示临床治疗时应尽量采用该疾病所处经脉气血旺的时辰。
但在本实验中，模型组的凋亡率较正常组的稍高，是否因为较多数量的Eos本身能够使凋亡增加还需进一步研究。两治疗组的Eos计数、Eos凋亡率尚未恢复至正常水平，可能与治疗时间较短有关。另一方面也说明了哮喘是一种慢性顽固性疾患，提示纳子法对哮喘气道局部炎症的长期治疗效果有待于进一步的实验及临床观察来确定。
参考文献
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