关于黑色素瘤抗原A3致敏的树突状细胞对人肝癌细胞的体外杀伤作用

作者：肖刚 石灵春 谭敏 张维彬 杨海峰 文剑明

【摘要】 【目的】观察经黑色素瘤抗原A3（melanoma antigen gene，MAGEA3）致敏树突状细胞（dendritic cells，DCs）活化的淋巴细胞对人肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）细胞的体外杀伤作用。【方法】采用粒—巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte / macrophage colonystimulating factor，GMCSF）和白介素4（interleukin4，IL4）从人外周血中诱导树突状细胞，经MAGEA3抗原致敏后与T淋巴细胞共培养，以淋巴细胞为效应细胞，分别以表达MAGEA3抗原的肝癌细胞株H4M、不表达MAGEA3抗原的正常肝细胞为靶细胞，收集T淋巴细胞进行肿瘤细胞杀伤试验。【结果】负载MAGEA3抗原的DCs激活的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对肝癌细胞有明显的杀伤作用，其对肝癌细胞的杀伤率显著性高于正常肝细胞对照组（P＜005）。【结论】MAGEA3蛋白抗原致敏的树突状细胞疫苗可激活特异性的CTL，在体外诱导出较强的对人肝癌细胞株的细胞毒作用。
【关键词】 肝肿瘤，实验性；抗原，肿瘤；肿瘤细胞，培养的；癌症疫苗
　　
　　【Objective】To observe the invitro cytotoxicity of dendritic cells (DCs) sensitized with melanoma antigen gene A3 (MAGEA3) against human hepatocellular carcinoma (HCC) cells.
　　
　　【Methods】DCs were induced with granulocyte/macrophage colonystimulating factor (GMCSF) and interleukin4(IL4) from peripheral blood mononuclear cells．After DCs were sensitized with MAGEA3 and cocultured with T lymphocytes，effector cells of cytotoxic T lymphocyte (CTLs) were obtained.Respectively with hepatocellular carcinoma cell line H4M (expressing MAGEA3) and normal hepatocytes (not expressing MAGEA3 ) as target cells，the cytotoxicity of CTLs was observed.
　　
　　【Results】The CTLs activated by DCs which were sensitized with MAGEA3 had an obvious invitro cytotoxic effect against HCC cells，and the killing rate in HCC cells group was much higher than that in normal hepatocytes group （Ｐ＜００５）.
　　【Conclusion】The vaccine of DCs sensitized with MAGE3 can activate the tumor specific CTL activity and possesses an invitro cytotoxic effect on HCC cell line.
　　Key words：LIVER NEOPLASMS，EXPERIMENTAL；ANTIGEN，NEOPLASMS；TUMOR CELLS，CULTURED；
　　人黑色素瘤抗原A3（melanoma antigen gene，MAGEA3）在多种肿瘤组织中表达，而且在肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）中也有较高频率的表达，但在正常组织中除胎盘和睾丸外均不表达［1］，因此在抗肿瘤免疫治疗中是理想的靶抗原。树突状细胞（dendritic cells，DCs）是体内唯一能激活初始型T细胞的专职抗原提呈细胞，DCs在诱导机体产生特异性抗肿瘤免疫反应中具有特别重要的作用［2］。本研究中，我们以纯化的MAGEA3蛋白为抗原诱导DCs激发特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）对HCC细胞进行体外杀伤试验，为临床应用MAGEA3开展针对HCC的免疫治疗提供实验依据。
　　１材料与方法
　　11质粒与细胞株含MAGEA3 cDNA的重组质粒pGEX4T1MAGEA3为本室自行构建。肝癌细胞株H4M及正常肝细胞株L02由中山大学第一附属医院病理科原代培养建株。
　　12主要试剂RPMI1640培养基购自Gibcobrl公司；胎牛血清购自Hyclone公司；重组人粒细胞 / 巨噬细胞集落刺激因子（recombination human granulocyte / macrophage colonystimulating factor，rhGMCSF）、重组人白细胞介素4（recombination human interleukin4，rhIL4）、重组人白细胞介素2（recombination human interleukin4，rhIL2）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα，TNFα）均购自Perprotech公司；植物血凝素（phytohaemagglutinin，PHA）、二甲基亚砜（dimethy1 sulfoxide，DMSO）、四甲基偶氮唑盐［3(45dimethylthiazol2y1)25diphenyltetrazolium bromide，MTT］、淋巴细胞分离液Ficoll均购自上海生化试剂二厂；异硫氰酸荧光素（FITC）标记的小鼠抗人CD80、CD86单克隆抗体及藻红蛋白（PE）标记的小鼠抗人CD83、人类白细胞抗原DR（human leucocyte antigenDR，HLADR）单克隆抗体均购自Pharmingen公司；兔抗人MAGEA3多克隆抗体购自NeoMarkers公司。
　　13MAGEA3蛋白的分离与纯化重组质粒pGEX4T1MAGEA3转化大肠杆菌BL21，经异丙基硫化βD半乳糖苷（isopropylthioβDgalactoside，IPTG）诱导表达。取1 000?mL诱导表达的菌液，10 000?g、4℃离心5?min；菌体沉淀用50?mL磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）重悬，冰浴，超声裂解细菌，加入Triton X100至终体积分数为1%，混匀，冰浴放置30?min；12 000?g、4℃离心?20?min；取上清液，采用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecy1 sulfatepolysacrylamide gel eletrophoresis，SDSPAGE）鉴定目的蛋白的可溶性。用5 mL谷胱苷肽硫转移酶（glutathinStransferase，GST）层析柱分离融合蛋白，经SDSPAGE及凝胶薄层扫描鉴定纯化蛋白的纯度；PBS透析24?h，过滤除菌，-70℃保存。
　　14DCs的体外培养及抗原致敏采用Ficoll常规分离5名正常献血员外周血获得单个核细胞，调整其细胞密度为2×106／mL，加1?mL于24孔板中，在37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养3?h后，吸去悬浮细胞，加入DCs培养基（含rhGMCSF 100?ng/mL、rhIL4 50?ng/mL的RPMI1640），在37 ℃、体积分数为5%的CO2条件下培养，每3?d换液1次。通过倒置显微镜观察DCs树突状外形，同时采用流式细胞仪检测DCs表面HLADR、CD80、CD83、CD86的表达。收集第7天的DCs，调整细胞浓度为3×106个/mL，接种于24孔板中，分别加入GSTMAGEA3蛋白（20?μg / mL） 50、100、200、300 μL，GST蛋白（20?μg/mL）100?μL和PBS 100?μL培养24?h；加入TNFα(50?U/mL)，继续培养2?d。
　　
　　15细胞株的培养分别传代培养正常肝细胞株L02和肝癌细胞株H4M；将细胞悬液（浓度为1×105个/mL）制成爬片，免疫组化染色检测MAGEA3蛋白的表达。
　　16T淋巴细胞的制备及CTL的体外诱导取同1个体外周血，Ficoll常规分离单个核细胞，用培养液调整其细胞密度为1×106/mL；按照淋巴细胞与DCs细胞数量比为5∶1的比例混合培养后，分以下几组：A组为未与DCs混合培养的淋巴细胞（空白对照组）；B组为淋巴细胞+DCs（未负载融合蛋白，以PBS替代）；C组为淋巴细胞+DCs（负载20?μg/mL融合蛋白50?μL）；D组为淋巴细胞+DCs（负载20?μg/mL融合蛋白100?μL）；E组为淋巴细胞+DCs（负载20?μg/mL融合蛋白200?μL）；F组为淋巴细胞+DCs（负载20?μg/mL融合蛋白300?μL）；G组为淋巴细胞+DCs（负载20?μg/mL?GST蛋白100?μL）。每3?d半量换液，补充PHA和rhIL2，以促进DCs的成熟，增强DCs的抗原提呈能力；于37℃、体积分数为5%CO2、饱和湿度培养箱中培养7?d，实验终止前4?h，每孔加入新鲜配制的5?mg/mL的MTT?20?μL，倒置显微镜下观察；1?000?r/min离心5?min，去上清液，每孔加入DMSO 150?μL，振荡5?min，于酶标仪上570?nm处读取吸光度(D)值，按下列公式计算刺激指数：Is=D实验组/D空白对照组。然后，调整淋巴细胞与DCs细胞数量比分别为10∶1、20∶1、50∶1、100∶1，同样按照上述A至G的分组重复以上实验步骤，以比较不同组淋巴细胞的增殖能力，每组计数3次，取平均值。以未与DCs混合培养的淋巴细胞作为空白对照。
　　17CTL的杀伤效应以培养第7天的淋巴细胞为效应细胞，以MAGEA3阳性的H4M肝癌细胞为靶细胞，按效靶比（细胞数量比）为10∶1，在以下各组中同时加入淋巴细胞和靶细胞进行杀伤实验，其中靶细胞为2×104个/孔，效应细胞做相应调整；每组另设3个复孔，以PBS为空白对照，于37℃、体积分数为5%CO2培养箱孵育48?h。分组如下：Ⅰ组为肝癌细胞+经负载GSTMAGEA3融合蛋白的DCs刺激的淋巴细胞；Ⅱ组为肝癌细胞+经负载GST蛋白的DCs刺激的淋巴细胞；Ⅲ组为肝癌细胞+未负载GSTMAGEA3融合蛋白的DCs刺激的淋巴细胞；Ⅳ组为肝癌细胞+未经DCs刺激的淋巴细胞；Ⅴ组为淋巴细胞（效应细胞）；Ⅵ组为肝癌细胞（靶细胞）；以MAGEA3阴性的正常肝细胞L02为靶细胞，重复上述实验分组。然后，调整效靶比分别为20∶1、50∶1、100∶1，同样按照上述Ⅰ至Ⅵ的分组重复以上实验步骤，以比较不同效靶比情况下的CTL的杀伤效应。
　　18MTT法检测淋巴细胞的杀伤活性在结束培养前4?h吸弃上清，加入新鲜配置的MTT（5?mg/mL）20?μL/孔，置于37℃、体积分数为5%CO2培养箱孵育4?h；弃上清，加入DMSO?150?μL/孔，室温下振荡至结晶物溶解；在酶标检测仪上，用空白对照孔调零后测各孔D570值，对于D＜0者按照0值计算，计算杀伤率：p杀伤/%＝［Ｄ靶细胞-(D效靶细胞-D效应细胞)］/D靶细胞×100%。
　　19统计学处理统计学处理使用统计软件SPSS 100完成。
　　2结果
　　21MAGAA3基因的表达与纯化重组质粒pGEX4T1MAGEA3转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导后，含重组质粒pGEX4T1MAGEA3的大肠杆菌BL21能够表达约分子量72?kD的蛋白，其中GST蛋白分子量约为26?kD，超声裂解细菌后取可溶性部分用GST层析柱分离纯化，得到了分子量约为72?kD的蛋白（图1）。经SDSPAGE及凝胶薄层扫描鉴定纯化蛋白的纯度为20?μg/mL。
　　22DCs的培养及鉴定Ficoll法常规分离正常献血员外周血获得单个核细胞，以适量GMCSF和IL4诱导培养树突状细胞。在培养第2天，大部分细胞贴壁生长，细胞形态出现不规则改变，少量细胞悬浮并聚集成团，周边可见少量突起（图2-a）。第7天可见悬浮细胞明显增多，贴壁细胞较少，细胞体积增大，胞内颗粒增粗，颜色加深，从胞体周围伸出多个长短不一的树突状突起（图2-b）。DCs培养第9天，流式细胞仪检测结果显示CD80、CD83、CD86、HLADR表达均较高（图3），其中CD80为588%、CD83为7320%、CD86为7282%、HLADR为9444%。
　　23细胞株中MAGEA3蛋白的表达采用免疫组化二步法检测肝癌细胞株H4M的MAGEA3蛋白，可见H4M多数细胞浆有棕黄色颗粒（图4），而正常肝细胞株L02为阴性。因此，以MAGEA3阳性的H4M肝癌细胞为淋巴细胞攻击的靶细胞，而MAGEA3阴性的正常肝细胞株L02为阴性对照组。
　　24淋巴细胞增殖效果的检测将淋巴细胞与负载抗原的DCs混合培养7?d后，经MTT法检测淋巴细胞增殖情况，结果显示：DCs与淋巴细胞的比例为1∶50时，DCs刺激淋巴细胞增殖的效果最为显著（P＜005）。未负载抗原的DCs和负载抗原的DCs均有刺激同种淋巴细胞增殖的能力，后者各组刺激淋巴细胞增殖的能力均较前者增强（P＜005）。从组间比较结果来看，以GSTMAGEA3融合蛋白为100?μL(50?μg/mL)时所致敏的DCs对淋巴细胞的刺激增殖能力最强。在本组统计中还发现以未负载GSTMAGEA3的DCs和仅负载GST的DCs刺激淋巴细胞，2组间未见明显差异（P＞005）（结果见表1）。 　　25CTL杀伤活性的检测实验结果显示，经负载GSTMAGEA3融合蛋白的DCs刺激的淋巴细胞（Ⅰ组）对于H4M的杀伤率显著性高于其他3组（P＜005或P＜001），而经负载GST蛋白的DCs刺激的淋巴细胞（Ⅱ组）与未负载GSTMAGEA3融合蛋白的DCs刺激的淋巴细胞（Ⅲ组）相比较，二者对于H4M的杀伤作用无显著性差异（P＞005），但二者对于H4M的杀伤作用均高于未经DCs刺激的淋巴细胞（Ⅳ组）。从效靶比来看，第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的最高杀伤率均出现于1∶50时，显著性高于其他效靶比（P＜005）时的杀伤率。但在第Ⅳ组，各效靶比的杀伤率无显著性差异（P＞005）。以MAGEA3阴性表达的正常肝细胞株L02为靶细胞的杀伤实验组，其各组杀伤率均接近于0（结果见表2）。
　　图1－图4　略
　　表1不同数量DCs刺激淋巴细胞增殖的刺激指数比较　略
　　表2CTL对靶细胞的杀伤率　略
　　3讨论
　　DCs是已知的功能最强的专职抗原提呈细胞，起源于骨髓CD34+前体细胞，经血循环进入非淋巴组织，定居于上皮组织及除脑以外的实质脏器的间质。近年来的许多实验证实［3-4］，用肿瘤抗原冲击致敏DCs，可以在体内外诱导CTL的生成，激发机体产生特异性抗肿瘤免疫功能，并已在多种恶性肿瘤试验性治疗中取得令人振奋的效果。由于我国 HCC发病率高［5］，寻找适当的特异性抗原冲击致敏DCs，诱导产生针对HCC的主动特异性免疫治疗成为当务之急。MAGEA3抗原在HCC肿瘤组织中的表达率很高［6］。因此，理论上应用MAGEA3抗原致敏DCs诱导淋巴细胞将会产生针对HCC的特异性杀伤作用。DCs的致敏可采用多种形式的抗原，其中应用肿瘤抗原多肽冲击致敏DCs，可以产生“冲击致敏”效应，促进CTL的有效激活。但在MAGEA3蛋白分子内已知至少有5个MHCⅠ类分子限制的表位和4个MHCⅡ类分子限制的表位［7］，并不断有新的表位表现。人工合成MAGEA3分子内MHCⅠ类分子限制CTL表位肽段，在体外确能诱导出特异性抗肿瘤免疫应答，但小肽在体内很容易被降解，且受特定的HLA表达型的限制。根据MAGEA3已知抗原表位设计多表位疫苗可以激发针对几种不同抗原表位的CTL，但由于对表位的认识还不够充分，所谓的多表位疫苗可能还是遗漏了某些重要的表位［8］。另一方面，在中国HCC患者中表达的MAGE抗原可能存在变异，从而影响了多肽疫苗的效果［9］。因此，获得包含多抗原表位的MAGEA3完整蛋白对提高肿瘤免疫治疗效果非常重要。在本研究中，使用MAGEA３完整蛋白作为抗原，它不仅含有CTL表位及CD4+T细胞表位，而且作用不被特定的HLA表型限制，因此免疫效果更好，使用范围更广泛。本研究中采用pGEX4T1原核表达质粒，对于表达、纯化和检测大肠杆菌表达的融合蛋白是有用的工具。pGEX4T1带有非常强的T7启动子、终止子和抗Amp基因，其本身表达1个分子量26?kD的GST蛋白，该系统可以克服转录与转录后水平对外源基因表达可能带来的不利影响，便于融合基因翻译起始，是一种高效的蛋白表达载体，并可用商品化的谷胱苷肽琼脂糖通过亲和层析方便地从细菌裂解物中纯化蛋白，因此获得的蛋白适合抗体和疫苗的制备。本研究采用GSTMAGEA3抗原致敏的DCs所诱导产生的CTL对表达MAGEA3的肝癌细胞株H4M细胞产生了明显的杀伤作用，该组对肝癌细胞的杀伤率显著性高于未致敏DCs诱导CTL组、未经DCs诱导CTL组和GST致敏DCs诱导CTL组（均P＜005），而对不表达MAGEA3的正常肝细胞无杀伤作用。上述结果表明GSTMAGEA3全蛋白可作为治疗HCC的候选疫苗。另一方面，采用PBS及GST抗原刺激的DCs所活化的CTL对HCC细胞的杀伤作用比较无显著性差异（P＞005），表明GSTMAGEA3抗原对于活化DCs和诱导产生CTL的功能部分为MAGEA3抗原，而GST部分对于上述功能的发挥无直接作用。本研究采用GSTMAGEA3抗原成功致敏DCs，并进一步活化了针对MAGEA3特异性HCC细胞的CTL，在体外成功进行了诱导杀伤，为临床直接应用GSTMAGEA3蛋白治疗HCC提供了实验依据。
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