作者：李显澎 樊粤光 刘建仁 范海蛟 江晓兵 孙志刚 曾建春 阳建权
【摘要】 【目的】研究大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的分离纯化和在诱导条件下的成骨能力。【方法】取SPF级SD大鼠6只，采用全骨髓贴壁培养法分离成年大鼠骨髓间充质干细胞，取传至第3代的MSCs进行细胞形态和免疫组化鉴定；应用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的诱导分化培养液诱导传代细胞向成骨细胞分化，检测碱性磷酸酶（ALP）的活性和细胞矿化作用进行成骨细胞鉴定。【结果】全骨髓贴壁培养法能有效分离纯化大鼠骨髓MSCs，MSCs在含体积分数为10% 胎牛血清的低糖DMEM（L-DMEM）培养液中生长性状相对稳定，增殖速度快；诱导条件下，细胞ALP活性明显增高，并出现了矿化结节。【结论】建立了一种体外分离纯化、培养扩增大鼠骨髓MSCs的方法，成骨能力肯定，为中药蛋白质组学研究提供材料基础。
【关键词】 骨髓间充质干细胞/病理学； 细胞培养，体外的； 组织工程
骨髓间充质干细胞（MSCs）在体内外诱导因子的作用下，可向成骨细胞、成软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞、神经细胞和星形胶质细胞转化，具有很大的可塑性［1］，这使其在组织工程、细胞治疗等方面成为研究的热点［2］。为更好地将MSCs应用于骨质疏松症、骨坏死、骨缺损，本实验通过体外细胞培养的方法将MSCs从骨髓中分离纯化，观察MSCs在体外的扩增、鉴定，并诱导其定向成骨分化。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 动物 SD大鼠6只，SPF级，体质量140~160 g，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号为：0025033。
1.2 主要试剂与仪器 低糖DMEM （L-DMEM，美国Gibco 公司，GNM31600）；兔抗大鼠CD34（BA0532）、CD44（BA0321）、CD54（BA0541）（武汉博士德公司）；高糖DMEM（Hyclone，SH30022.01B）；胎牛血清（Hyclone，SV30087.01）；胰蛋白酶（Hyclone，SV30042.01）；β-甘油磷酸钠（美国Simga公司）；地塞米松（美国Sigma公司）；D-hanks（美国Simga公司）；维生素C（美国Sigma公司）；生物素化抗生蛋白链菌素复合物（streptavidin biotin complex，SABC）（SA1022）试剂盒（武汉博士德公司）；二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）（AR1022）（武汉博士德公司）；其他试剂均为国产分析纯。 C02恒温培养箱（Sheldon Manufactruing.Inc，model No: 2323-2 shellab，USA）；3k-15低温离心机（美国Sigma）；DL-CJ-IF超净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司），MPS 60倒置显微镜（Leika DMIRB）；超纯水系统（MILLPORE，SAS 67120MOISHEMA，France）
1.3 培养液配制 完全培养液：低糖DMEM（含体积分数为10％胎牛血清，10 g/L青霉素、链霉素）；诱导分化培养液：高糖DMEM（含体积分数10％胎牛血清，10 g/L青霉素、链霉素）中加入β-甘油磷酸钠、地塞米松、维生素C，终浓度分别为10 mmol／L、10-8 mol／L、50 μmol/L。
1 .4 骨髓间充质干细胞的分离［ 3-4］ 取健康成年SD大鼠（150 g左右），1 g/L新洁尔灭浸泡30 min后，断颈处死，碘伏消毒，体积分数为75%的酒精消毒，铺无菌单盖住上身；无菌条件下取双侧股骨、胫骨，除去骨表面附着的软组织，用L-DMEM浸泡清洗;用弯钳将两端骨骺切除，显露骨髓腔。用10 mL注射器吸取L-DMEM培养液冲洗骨髓腔，以冲出骨髓；轻轻吹打，制成单细胞悬液；1 000 r/min离心20 min，离心后去上清，用完全培养液重悬，入培养瓶中，用完全培养液培养。
1.5 骨髓基质干细胞的原代和传代培养 将上述所得细胞悬液接种于25 mL塑料培养瓶中，置37℃ 、体积分数5%CO2饱和湿度条件下培养。于培养后的第3天更换培养液以更新细胞代谢环境。以后每3 d换液1次，去除未贴壁的细胞，待细胞汇合约80％时，用2.5 g/L胰蛋白酶+0.4 g/L乙二胺四乙酸（EDTA）消化，按1：2传代培养。
1.6 大鼠骨髓MSCs的生长曲线测定 取生长良好的第2、3代细胞（P2、P3），2.5 g/L 胰蛋白酶消化，1×104／mL接种于24孔板，每天各取3孔消化计数，每孔计数3次，连续7 d。以培养时间为横坐标，细胞数为纵坐标，描绘生长曲线（图1）。
图1 大鼠骨髓MSCs生长曲线（略）
Figure 1 Growth curve of rat MSCs
1.7 骨髓间充质干细胞的鉴定［5］ （1）细胞形态：细胞呈梭形，边缘清晰整齐，贴壁生长，呈成纤维细胞形态生长，呈旋涡形（图2）。（2）免疫组化：P3培养3 d后，去培养液，用40 g/L多聚甲醛固定；于体积分数3%的双氧水中室温下放置10 min；磷酸盐缓冲液（PBS）洗2 min，共3次；滴加正常山羊血清，室温10 min，除去多余液体，滴加多克隆兔抗大鼠CD34、CD44、CD54，4℃过夜；0.01 mol/L PBS洗5 min， 共3次，滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃作用20 min，0.01 mol/L PBS洗5 min 共3次；滴加SABC，37℃作用20 min，0.01 mol/L PBS洗5 min，共4次；DAB显色，取1 mL双蒸水，加试剂盒A、B、C 试剂各1滴，混和后加到切片，室温显色，镜下控制反应时间。双蒸水洗涤，苏木素复染2 min，时间按所需要的着色强度而定，双蒸水洗涤3次，每次2 min；放入烘箱 40℃烘干脱水，用树胶封片，干燥后观察。
1.8 骨髓间充质干细胞的诱导分化［6］ 培养第5代MSCs以1×105 个／mL的密度接种于6孔培养板（内铺有预处理的盖玻片），加完全培养液，48 h后观察细胞融合80%后，吸去完全培养液。实验组加入诱导分化培养液，对照组加入等量完全培养液，每3 d换液1次。
1.9 成骨细胞鉴定［7］
1.9.1 钙钴法测定碱性磷酸酶（ALP）活性 将细胞接种于预先放有盖玻片的6孔板内，于第5天时吸取出培养液，用PBS冲洗3次，每次1 min；中性福尔马林室温固定10 min后蒸馏水冲洗3次；加入新鲜的孵育液37℃孵育6 h，蒸馏水冲洗3次；20 g/L硝酸钴水（现配现用）溶液浸泡 5 min，蒸馏水冲洗3次；10 g/L硫化铵水溶液作用5 min，水洗，中性树胶固定，标记，镜下观察。
1.9.2 矿化结节染色 诱导10 d后吸取出培养液，PBS清洗3次，体积分数95%的乙醇固定30 min，PBS清洗3次，1 g/L茜素红染色，双蒸水冲洗3遍，中性树胶固定，标记，镜下观察。
2 结果与分析
2.1 细胞的原代培养 培养的原代细胞接种72 h后，出现较多贴壁细胞，经冲洗和换液，去除悬浮细胞，贴壁细胞继续培养。4 d后细胞开始增殖，生长良好，贴壁较均匀，倒置显微镜观察活体细胞形态：MSCs呈纤维状，梭形，有突起；约7 d时，细胞汇合成片，其融合率可达到80％（图2）。
2.2 细胞的传代培养 将原代培养的细胞用胰蛋白酶消化并吹打制成单细胞悬液，传代培养。传至第5代，细胞密集重叠生长，梭形，呈旋涡状。传代的MSCs生长快慢与接种密度关系密切（图3）。实验发现骨髓MSCs的生长性状基本稳定， 二代细胞的形态、生长曲线无显著性差异，细胞为均一的成纤维细胞样，潜伏适应期在第1～2天（约24 h），对数生长期为第3～5天 （约72 h），以后进入平台期，在对数生长期，群体倍增时间34 h，传代周期约6 d，每传代1次细胞增加约2.2倍，有学者统计单个MSC经20次扩增，细胞数可达8×1 05～1.5×106个，说明MSCs适应能力强，增殖速度快，体外扩增容易，有巨大的扩增潜能。另外，从理论上讲，在体外设法诱导或用外源目的基因导入等技术，可使细胞进行对称性有丝分裂，从而无限扩增而不分化。因此，MSCs可作为组织工程的种子细胞及细胞治疗和基因治疗的载体，用于疾病和损伤的治疗。 P3培养5 d后，进行细胞免疫组化检测。CD29、CD44、CD54、CD73、CD105、CD166 表达阳性 ，而CD14、CD34、CD45表达阴性 ，我们选用CD44、CD34、CD54进行鉴定。图4结果显示在MSCs膜上呈深红色，不透光为MSCs特性：CD44（+）、CD54（+），不表达为造血干细胞的特性：CD34（-）。
2.3 细胞ALP活性测定 经诱导后的细胞，碱性磷酸酶染色明显，胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀，ALP活性部位呈棕黑色（图5）。
2.4 细胞矿化作用检测 连续培养10 d后，细胞呈复层生长，茜素红染色可见红色的矿化结节颗粒，颗粒大小不均一，提示有矿化基质沉积（图6）。
图2 原代培养第7天时形成的MSCs集落（×50）（略）
Figure 2 Feature of MSCs after primary culturing for 7 days
图3 MSCs第5代呈旋涡状（×100）（略）
Figure 3 Features of MSCs after subculture for 5 generationsa.CD34（-）b.CD44（+）c.CD54（+）
图4 MSCs免疫组化鉴定结果（×50）（略）
图5 成骨诱导后第5天（碱性磷酸酶染色，×100）（略）
Figure 5 Osteoblastic identification after induction for 5 days
图6 成骨诱导后第10天（茜素红染色，×50）（略）
Figure 6 Osteoblastic identification after induction for 10 days
3 讨论
MSCs在骨髓中的丰度不高，约占有核细胞的0.001％ ～0.01％ ，因此进行分离纯化和体外繁殖培养就显得尤为重要。研究表明［4］，骨髓液中的造血干细胞与基质细胞互相影响，相互作用，维持细胞生长。为此，我们采用了全骨髓结合贴壁法。早期，培养成分中骨髓造血干细胞对BMSCs的生长有利；待BMSCs贴壁、生长繁殖后，造血干细胞可被清除。因此，省略前期的细胞分离对骨髓MSCs的生长影响不大。
许多研究表明［6-8］，地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C是MSCs向成骨细胞分化和体外成骨的必要条件。地塞米松可促进成骨细胞分化成熟，同时提高ALP的活性，调节成骨细胞分泌胰岛素样生长因子（insulin-like growth factors，IGFs），促进细胞外基质胶原合成。维生素C能促进培养细胞合成胶原，形成钙化，并能调节ATP、ALP活性和非胶原基质蛋白的合成。β-甘油磷酸钠能为成骨细胞提供磷酸离子，促进生理性钙盐的沉积和钙化，是MSCs发生矿化结节的必要条件。ALP是成骨细胞的功能性酶，在钙盐沉积中起关键性作用；ALP能够水解有机磷酸酶，使局部磷酸根浓度增高，而且可以破坏钙化抑制剂，从而启动钙化。因此ALP活性的提高是MSCs向成骨细胞分化的重要标志。因而人们常用细胞中该酶的活性高低来检测成骨细胞的存在和成骨细胞的分化成熟程度。诱导分化的MSCs随培养时间的延长，ALP活性逐渐增高，大量成骨细胞形成。随着ALP活性的提高，钙盐沉积在胶原纤维上，形成钙化结节。
种子细胞的选择与培养是骨组织工程中的基本环节，目前可作为种子细胞的来源主要有：骨、骨髓、骨膜和骨组织中的干细胞。MSCs有取材方便、安全，对供体损伤小，易于分离培养，体外增殖能力强等优点，在一定条件下，可以定向诱导分化为成骨细胞［9］。本实验室正准备筛选出一批对促进MSCs和其成骨分化的补肾中药复方，拟建立用于防治骨质疏松症、骨坏死、骨缺损中药的蛋白质组学技术平台，利用此平台可将中药复方的多组分、多靶点、多途径作用特点与蛋白表达关联起来，比较不同治则中药复方的各自不同的蛋白表达靶点和对促进MSCs以及其成骨分化能力的影响；根据表达水平差异，阐明补肾中药复方的分子作用机制。
【
参考文献
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