【摘要】 【目的】观察参附注射液及高乌甲素注射液诱导白血病细胞株HL-60分化、凋亡的作用，初步验证温阳法治疗肿瘤的理论。【方法】采用人类急性白血病细胞株HL-60为模型，设参附注射液组（终浓度分别为12.5、25、50、100μL/mL），高乌甲素组（终浓度分别为25、50、100μL/mL），亚砷酸钠对照组（终浓度分别为0.25、2、15μmol/L）及阴性对照组；检测细胞增殖、细胞形态、硝基四氮唑蓝（NBT）还原能力、细胞周期分布、凋亡率等指标。【结果】参附注射液作用后HL-60细胞增殖受抑制，高乌甲素注射液对HL-60的生长无抑制作用；经药物处理60h后HL-60细胞均出现程度不同以凋亡为主的形态改变；低浓度参附注射液（12.5μL/mL）、高乌甲素注射液（50μL/mL）作用60h后HL-60细胞NBT还原能力增强，而其他浓度组 NBT还原能力反未增强；药物处理60h后，100μL/mL高乌甲素液及25.50μL/mL参附液流式细胞仪检测直方图上呈现亚二倍体凋亡峰，凋亡率呈不同程度增高。【结论】参附注射液、高乌甲素注射液对人类急性白血病细胞株HL-60具有不同程度的诱导分化和凋亡的双重作用，为温阳法治疗肿瘤提供了一定的理论依据。
【关键词】 参附注射液／药理学； 高乌甲素注射液／药理学； 白血病／中药疗法； 肿瘤细胞／病理学； 细胞凋亡；细胞培养
近年来中医药抗肿瘤研究领域根据《内经》“积之始生，得寒乃生，厥乃成积”、“阳化气，阴成形”的理论，逐步重视温阳法的研究［1-5］。乌头碱、人参皂苷类物质抗肿瘤的研究也逐渐开展，在常用的中药中，温阳作用效强力专者首推附子类药物，其中所含乌头碱类物质是其主要效应成分。结合我们临床应用温肾法为主治疗肿瘤经验，本文从诱导分化、凋亡角度，观察临床常用的温阳法代表针剂——参附注射液及乌头碱类药物高乌甲素（拉巴乌头碱、刺乌头碱）注射液对人类急性白血病细胞株HL-60的作用，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 主要药物 参附注射液每毫升相当于生药红参0.1g，附片0.2g，由雅安三九药业有限公司生产（批号：20043116）；氢溴酸高乌甲素注射液（2mg/mL，由广州天心药业股份有限公司生产 ，批号：040501）；亚砷酸氯化钠注射液由哈尔滨伊达药业有限公司生产（批号：20050302）。以上药物均购自广东省中医院药房，临用时以磷酸盐缓冲溶液（PBS）稀释。
1.2 主要试剂 二甲基亚砜（DMSO）、四甲基偶氮唑盐（MTT）均由Sigma公司生产；Wright-Giemsa混合染液由广州人仁公司提供；佛波酯（TPA）由Clbiochem公司生产；硝基四氮唑蓝（NBT）由Mbchem公司生产；碘化丙啶（PI）染色液由Becton Dickinson公司生产。
1.3 主要仪器 Bio-Rad-450型全自动酶标仪为美国Bio-Rad公司产品；150-400型细胞培养箱为英国Biotech公司产品；3169型倒置显微镜为日本Nikon公司产品；SW-CJ-IF型超净工作台为苏州净化设备厂产品；TGL-16型高速冷冻离心机为德国Sigma公司产品；NexPower1000型纯水器为韩国Human Corp产品； FACSCalibur型流式细胞仪为Becton Dickinson公司产品；普利生MIAS 2000型智能骨髓图像分析系统为北京—深圳普利生公司产品；Nikon E200型普通光学显微镜为日本Nikon公司产品。
1.4 细胞模型 HL-60细胞株购自中山大学动物中心细胞库，在广州中医药大学基础医学院生化教研室实验室传代培养。实验时取对数生长期细胞， 2g/L台盼蓝拒染实验证实活细胞数大于95%，并调整实验时所需密度。
1.5 实验方法和检测指标［6－9］
1.5.1 分组 设参附注射液、氢溴酸高乌甲素注射液实验组（简称参附液组、高乌甲素组），在实验的不同阶段，参附液组终浓度分别为12.5、25、50、100μL/mL，高乌甲素组终浓度分别为25、50、100μL/mL，亚砷酸钠对照组则取0.25、2、15μmol/L 3个浓度。并设空白（本底）对照组、阴性对照组。
1.5.2 细胞加药培养 在实验的不同阶段，按相应的设计要求接种制备好的细胞悬液到12或96孔培养板中（每孔细胞量见具体项目），分别加培养基及药物。96孔培养板中每孔加含体积分数为15%小牛血清的RPMI-1640培养基180μL，然后按不同浓度加药，最后不足200μL的孔则用PBS补足至每孔总体积为200μL；12孔培养板中每孔加含体积分数为15%小牛血清的RPMI-1640培养基至终体积2.5mL，再按不同浓度加药。然后分别置入37℃、体积分数为5%CO2饱和湿度条件下的细胞培养箱培养。每天将接种好的培养板取出置于倒置显微镜下观察1～2次，以及时掌握细胞生长状况。
1.5.3 不同药物及浓度对HL-60细胞生长的影响 参附液、高乌甲素各设3个不同的药物浓度组，以细胞终浓度为2×104/mL接种到96孔培养板中，培养48h后采用MTT法检测各组存活率、半数抑制浓度（IC50）。
细胞增殖抑制的MTT测定：加药培养后每孔加入5g/L的MTT溶液20μL，在细胞培养箱孵育4h后取出，用1.5mL离心管离心去上清，每管加DMSO 150μL，按原顺序放回96孔板轻轻震荡15min，采用酶标仪在570nm波长下测定各孔D值，根据下列公式计算细胞存活率：p细胞存活=（D加药组/D对照组）×100%；根据文献［6］ 方法计算IC50。
1.5.4 不同作用时间对HL-60细胞生长的影响 参考1.5.3的结果，取96孔板接种细胞。高乌甲素组设终浓度为50μL/mL，参附液组设终浓度为50μL/mL，细胞终浓度为2×104/mL，分别在培养24、48、72h取出相应培养板，按上法进行MTT检测。计算各组存活率，绘制生长曲线。
1.5.5 细胞形态观察 进行1.5.3、1.5.4指标检测时每天将接种好的培养板取出，置于倒置显微镜下观察细胞生长状况1～2次。
12孔板中每孔接种2×105个细胞培养60h后用PBS漂洗2次后，以体积分数为70%的乙醇将细胞固定后收集固定细胞涂片，吹干， Wright-Giemsa混合染液及甲基绿—派诺宁染色，晾干后普通光学显微镜下，观察200个细胞进行分类计数，智能骨髓图像分析系统拍照记录。
1.5.6 NBT实验（还原反应比色法） 以每孔3×103个细胞接种到96孔板中培养5d后，1 000r/min离心5min收集细胞，再将细胞悬浮于200μL /孔的NBT溶液中（内含0.24μg/mL的TPA），放入培养箱中培养1h，细胞离心去上清液，每孔加入200μL DMSO，室温下震荡20min，在570nm波长下测定D值。
1.5.7 流式细胞仪检测细胞周期分布、凋亡率 12孔板中每孔接种2×105个细胞培养60h，用PBS漂洗2次，调整细胞至1×106个/mL，再加体积分数为70%的乙醇（-20℃ ）固定细胞过夜后，上流式细胞仪以PI单染法检测细胞周期分布、凋亡率。
1.5.8 统计学处理 采用Microsoft Excel软件进行统计分析。
2 结果
2.1 不同药物、浓度及作用时间对HL-60细胞的影响
2.1.1 不同浓度参附液和高乌甲素作用48h对HL-60细胞生长的影响 表1、图1结果显示，参附液对HL-60细胞生长有明显抑制作用，且呈现一定的浓度依赖性，作用48h半数抑制浓度（IC50）约为68μL/ mL；而高乌甲素对HL-60的生长无抑制作用。
表1 不同浓度的药物作用48h对HL-60细胞生长的影响（略）
Table 1 Effect of SI and LHI at different concentrations on HL-60 cell growth after culturing for 48 hours
统计方法：t检验；①Ｐ＜０.０１，与阴性对照组比较
2.1.2 各药物不同作用时间对HL-60细胞生长的影响 根据２.１.1结果，取参附液终浓度50μL/ mL及高乌甲素终浓度５0μＬ/ mL连续测定药物作用24、48、72h对HL-60细胞生长的影响，表2、图2结果显示参附注射液对HL-60有明显的生长抑制作用，且呈现一定的时间依赖性；高乌甲素对HL-60的生长无抑制作用。
图1 不同浓度药物作用48h HL-60细胞生长曲线（略）
Figure 1 Growth curve of HL-60 cells in various groups after culturing for 48 hours
图2 各药物不同作用时间HL-60细胞生长曲线（略）
Figure 2 Growth curve of HL-60 cells in various groups after culturing for 24，48 and 72 hours
2.2 细胞形态观察
2.2.1 倒置显微镜下的细胞形态 加药培养24h各组细胞数目均有增加，生长状态良好，胞膜完整；48h后阴性对照组和高乌甲素组的细胞数目继续增加，而参附液组细胞生长受到抑制，不同浓度差异较大，高浓度组细胞出现明显皱缩或崩解，低浓度组细胞大部分完整，少数出现胞膜不完整，中浓度基本介于高低之间；72h后阴性对照组和高乌甲素组细胞数目仍在增加，胞膜尚完整，胞浆透明，而参附液组细胞数明显减少，胞膜不完整，胞浆颗粒增多，碎裂细胞明显增多，与MTT测定结果一致。
2.2.2 Wright-Giemsa混合染色的细胞形态 培养60h后，细胞经Wright-Giemsa混合染色后形态大致分为4类：①基本保持原始粒细胞形态；②出现轻度分化、凋亡、退变特征的细胞；③比较明显的凋亡特征：体积缩小，胞浆着染变浅不均匀，有空泡变性，胞膜不规则、皱缩，核染色质浓聚，形状不规则，染色质分布不均匀，或固缩，核仁不明显或消失，类似临床血液细胞学“固缩退变细胞”；④类似临床血液细胞学“肿胀退变细胞”的细胞：体积增大肿胀，胞浆着染变浅不均匀，有空泡变性，胞膜不规则、不完整，染色质浓聚而核肿胀，形状不规则，分布不均匀，核仁不明显或消失。罕见明确对应原始粒细胞以下的粒单系细胞分化成熟各阶段分类特征的细胞，亦罕见核碎裂和凋亡小体，仅偶见固缩细胞中有类似已进入终末分化的中性粒细胞（晚幼粒细胞、杆状核细胞、分叶核细胞）的细胞。细胞形态变异见图3，各种形态细胞大致分类见表3。
表3、图3结果显示经药物处理后HL-60细胞出现了部分类似于凋亡、分化的变异，尤以参附液组较明显，高乌甲素组较弱，与倒置显微镜观察结果大体一致。
表2 各药物作用24、48、72h对HL-60细胞生长的影响（略）
Table 2 Comparison of HL-60 growth in various groups after culturing for 24，48 and 72 hours
统计方法：t检验；①Ｐ＜０.０１，与阴性对照组比较
表3 药物作用60h后HL-60细胞形态特征变化分类（略）
Table 3 HL-60 cell morphological classification in various groups after culturing for 60 hoursp
表4 不同浓度的药物对HL-60细胞NBT还原能力的影响（略）
Table 4 Comparison of NBT reduction ability of HL-60 in different groups
统计方法：t检验；①Ｐ＜０.０５，与阴性对照组比较
2.2.3 甲基绿—派诺宁染色的细胞形态 甲基绿—派诺宁染色标本见各组细胞形态大致与Wright-Giemsa混合染色标本相同，大部分细胞浆呈红色着染，因而③类细胞、④类细胞都可视为凋亡细胞。细胞形态变异见图4。
2.3 NBT实验 不同浓度的药物对HL-60细胞NBT还原能力的影响见表4。结果显示50μL/mL的高乌甲素、12.5μL/ mL的参附液作用60h后HL-60 NBT还原能力增强，而100μL/mL高乌甲素和25、50μL/mL的参附液以及亚砷酸钠各浓度作用60h后HL-60 NBT还原能力未增强。
2.4 不同浓度药物作用后对HL-60细胞的周期分布及凋亡率的影响 表5结果显示，各药物作用对HL-60细胞的周期分布无明显影响；100μL/mL的高乌甲素及25、50μL/ mL的参附液作用60h后HL-60细胞凋亡率较阴性对照组有所增高，流式细胞仪检测直方图（图5）可见亚二倍体凋亡峰。
表5 药物作用60h 对HL-60细胞周期分布及凋亡率的影响（略）
Table 5 Effect of SI and LHI on HL-60 cell cycle and apoptotic rate after culturing for 60 hours
a.阴性对照组（原始粒细胞）b.25μL/mL参附液组（肿胀退变细胞和固缩退变细胞）c.50μL/mL参附液组（固缩退变细胞）d.100μL/mL高乌甲素组（轻度变异细胞）
图3 不同浓度药物处理60h后HL-60细胞形态（Wright-Giemsa混合染色，×100）（略）
Figure 3 HL-60 morphological features in different groups after culturing for 60 hours （Wright Giemsa stain，×100）
a.阴性对照组（原始粒细胞）b.25μL/mL参附液组（肿胀退变细胞和固缩退变细胞）c.50μL/mL参附液组（肿胀退变细胞和固缩退变细胞）d.100μL/mL高乌甲素组（轻度变异细胞）
图4 不同浓度药物处理60h后HL-60细胞形态（甲基绿—派诺宁染色，×100）（略）
Figure 4 HL-60 morphological features in different groups after culturing for 60 hours （UNNA stain，×100）
a.阴性对照组b.25μL/mL参附液组c.50μL/mL参附液组d.100μL/mL高乌甲素组
图5 不同浓度药物处理60h后HL-60细胞流式细胞仪检测直方图（略）
Figure 5 Flowcytometry graph of HL-60 after culturing for 60 hours in different groups
3 讨论
本观察结果显示参附液具有抑制HL-60细胞增殖的作用，高乌甲素短期作用无抑制HL-60细胞增殖的作用；参附液、高乌甲素在一定的浓度范围内具有诱导HL-60细胞分化、凋亡作用，且其作用互相重叠，趋向于低浓度下以诱导分化为主，高浓度下以诱导凋亡为主，其中参附液作用较强，与文献［6］高乌甲素诱导HL-60细胞分化、凋亡作用较弱结果一致。本文结果与有关人参皂苷［10-14］、乌头碱类物质［2，15-17］的相关研究大致相符。 高乌甲素作用后HL-60细胞存活率未见降低，甚至&>100%，结合细胞形态检测，并根据粒细胞的自然生长规律，考虑此时HL-60细胞被诱导后至多分化到中幼粒细胞阶段，细胞增生仍较旺盛；12.5μL/ mL参附液组、50μL/mL高乌甲素组NBT还原能力增强，提示低浓度下具有一定诱导HL-60细胞分化作用，而25、50μL/mL参附液组，100μL/mL高乌甲素组 NBT还原能力未增强反而下降，结合增殖抑制测定、细胞形态检测，主要考虑该较高浓度组细胞已死亡、标本总体酶活性下降所致，但不能排除仍存活的细胞有较高的NBT还原率；阳性对照药物亚砷酸钠的诱导分化、凋亡作用已为国内外一致公认，虽定位为西药制剂，但砷剂亦为传统中药，其性大辛大温。虽然亚砷酸钠对HL-60细胞作用的报道有较大差异，但其对HL-60细胞的NBT还原能力无影响［18］，本研究结果与之一致，且中、高浓度亚砷酸钠组NBT还原能力下降，考虑是缘于细胞死亡，甚至是非特异性作用。
另外，药物作用后凋亡率偏低，与形态观察细胞变异似乎形成较大差异，考虑可能跟PI单染检测方法（主要检测凋亡晚期细胞）有关，其敏感性不如 Annexin-V/PI双染法［7］。药物作用对HL-60细胞的周期分布无明显影响，可能与标本量较少及药物的作用特点有关。既往研究已明确，细胞凋亡可以启动于细胞周期的各时相［19］。
我们前期提出了“温肾祛瘀” 诱导凋亡、诱导分化的理论假说［20］，并于临床应用以温阳法的参附类针剂为主治疗肿瘤取得一定疗效，尤其白血病患者外周血细胞形态出现了类似抗磷脂抗体（APL）及应用全反式维甲酸（ATRA）或砷剂的改变［21-22］，本实验结果尤其参附注射液的效应与前期研究一致。
近年来人参皂苷、乌头碱类物质抗肿瘤的研究渐多，但单体物质的研究往往与中医临床脱节。参附注射液由中药汤剂参附汤改剂型而成，有效成分主要为人参皂苷与水溶性生物碱，且附子用量比例较原方增大，辨证使用可减轻多种肿瘤化疗毒性反应及改善生活质量，增强免疫功能，且毒副作用轻微。近期研究发现其对骨髓瘤细胞生长具有抑制作用［23］。
氢溴酸高乌甲素注射液临床上原作为一种非麻醉性镇痛药开发使用，为乌头碱类制剂［24-25］，最近报道在动物实验中有抗肝癌作用［15］。本实验提示其抗癌机理与诱导分化、凋亡相关。本文观察结果为温阳法治疗恶性肿瘤提供了一定的理论依据，其确切机制有待进一步探讨。
【
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