关于溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠结肠粘膜NFκB p65蛋白表达及血清TNFα含量的影响

论文网：

【摘要】 观察溃结灵对溃疡性结肠炎（UC）大鼠结肠粘膜核因子κB（NFκB）p65蛋白表达及血清肿瘤坏死因子α（TNFα）的影响。【方法】将SD大鼠60只随机分为6组，即正常组，模型组，柳氮磺胺吡啶（SASP）组（剂量为0.5g·kg-1·d-1），溃结灵高、中、低剂量组（剂量分别为18.3、9.2、4.6g·kg-1·d-1）。除正常组外，其他各组均采用三硝基苯磺酸（TNBS，100mg·kg-1)复制UC模型；采用酶联免疫（ELISA）法检测血清样本中TNFα的含量；处死动物，取结肠组织固定，组织切片进行免疫组织化学染色，光镜下计数NFκB p65阳性细胞表达率，并进行统计学分析。【结果】溃结灵高、中剂量组血清TNFα含量及结肠粘膜NFκBp65蛋白阳性细胞表达率显著性低于模型组（均P＜0.01）。【结论】 溃结灵可降低大鼠结肠粘膜NFκB p65蛋白表达及血清TNFα的含量，这可能是其治疗UC作用的机理之一。
【关键词】 溃结灵/药理学 溃疡性结肠炎/中药疗法 肠粘膜/病理学 疾病模型 动物 大鼠
　　溃疡性结肠炎(ulcerative colitis ，UC) 又称非特异性溃疡性结肠炎，是炎症性肠病（IBD）的一种，近年来国内报告日渐增多［1］。 UC的发病机制目前尚不清楚，但肿瘤坏死因子α（TNFα）是公认的能介导UC发病的细胞因子之一［2］，而核因子κB（NFκB）在IBD的病理生理过程中可能起到枢纽作用［3］。研究表明：NFκB调控着UC患者细胞因子的释放，细胞因子包括TNFα刺激能导致NFκB的活化［4］。NFκB最常见的形式是由p50与p65亚基组成的异二聚体，p65亚单位是主要的促炎单位。脾胃研究所在多年临床实践的基础上，以清热健脾活血为治则，总结出溃结灵用于治疗UC的中药复方，临床及实验研究表明该治则对UC有较好的治疗效果［5］。在前期工作基础上，本研究观察了溃结灵对UC大鼠结肠粘膜NFκB p65蛋白表达和血清TNFα含量的影响，以期对溃结灵治疗UC作用的机制进行探讨。现将结果报道如下。
　　1 材料与方法
　　1.1 动物 SD大鼠，SPF级，雄性，体质量180～220g，由广东省医学实验动物中心提供，合格证号：粤监证字2005A010。
　　1.2 药物 溃结灵（主要由水蛭、救必应、白芍、炙甘草等组成）药材购于采芝林连锁药店，经广州中医药大学中药学院中药标本中心张秋镇老师鉴定，所购药材均符合中华人民共和国药典标准，按组方比例称取药材，常规方法制备水煎液。大鼠低、中、高剂量按成人用量的5、10、20倍给药，即4.6、9.2、18.3g·kg-1·d-1；维柳芬（柳氮磺胺吡啶，SASP）为上海三维制药有限公司产品，批号：200410001，大鼠按成人用量10倍给药，即0.5g·kg-1·d-1。
　　1.3 主要试剂与仪器 兔抗大鼠 NF kappa B p65 单克隆抗体由美国NeoMakers公司生产，批号：9034P501D；免疫组化试剂盒由晶美生物工程有限公司生产，批号：DEC 022005；乙二胺四乙酸（EDTA）抗原修复液（pH 9.0，50倍浓缩液，用蒸馏水稀释后使用），由北京中杉金桥生物技术有限公司生产，批号：501101；大鼠TNFα酶联免疫双抗体夹心（ABCELISA）试剂盒，由上海森雄科技实业有限公司进口分装，批号：0507170；SFC18型生物显微镜由厦门麦克奥迪公司生产；3K30Z型高速冷冻离心机由Sigma公司生产；A5002型酶标仪由Tecan公司生产。
　　1.4 模型复制［6］ 采用三硝基苯磺酸（TNBS）灌肠法复制UC大鼠模型。取3月龄SD大鼠60只，造模前禁食24h，留取10只作为正常组，其他大鼠乙醚麻醉，用大鼠灌胃针头轻轻从肛门插入，深度为8cm，推入100mg·kg-1 TNBS溶液，捏紧肛门平放5min，术后常规饲养。
　　1.5 给药方法 造模后第3天，造模动物分为模型组，溃结灵低、中、高剂量组，以及阳性对照SASP组，每组各10只，分别按设计剂量给药，模型组及正常组给予等容积蒸馏水，每天1次，均连续10d。
　　1.6 标本处理 治疗结束后，大鼠禁食24h，在乙醚麻醉下眼眶采血3mL，4℃冰箱中静置3h，然后3000r/min离心15min，吸出血清另管存放于-20℃冰箱中备用。采血后处死大鼠，选择结肠病变最严重的部位剪取2cm，放入体积分数为10%中性缓冲福尔马林溶液中固定。
　　 1.7 免疫组化染色 按常规包埋，切片，厚度4μm。按试剂盒操作说明进行免疫组化染色。在光镜下，细胞浆和细胞核内出现棕黄色颗粒的细胞为NFκB p65阳性细胞。在40倍高倍镜下选取典型视野计数1000个细胞，其中阳性细胞数作为NFκB p65计数值，并以百分率表示。
　　1.8 TNFα含量检测 按试剂盒说明书进行操作，每孔加样量为100μL，终止反应后用酶标仪在492nm处测吸光度（D）值。所有D值均减除空白值后再进行计算。以标准品1000、500、250、125、62、31、16、0pg/mL之D值在半对数纸上作图，画出标准曲线。根据样品D值在该曲线上查出相应TNFα含量。

　　1.9 统计学分析 采用SPSS11.0软件进行统计分析。
　　2 结果
　　2.1 溃结灵对UC大鼠结肠粘膜组织NFκB p65蛋白表达的影响
　　表1结果表明：模型组肠粘膜组织NFκB p65蛋白阳性细胞表达率显著性高于正常组(P＜0.01)，溃结灵中、高剂量组及SASP组阳性细胞率则显著性低于模型组(P＜0.01)。
　　图1结果显示：正常组腺体排列整齐，有少量棕黄色着色细胞（NFκB p65阳性反应细胞）；模型组腺体排列紊乱，有大量棕黄色着色细胞；溃结灵低剂量组腺体排列较整齐，阳性细胞较多；溃结灵中剂量组腺体排列较整齐，有一些阳性细胞；溃结灵高剂量及SASP组腺体排列整齐，阳性细胞较少出现。表1 溃结灵对UC大鼠肠粘膜NFκBp65蛋白表2 溃结灵对UC大鼠血清TNFα含量的影响表2结果表明，模型组血清中TNFα含量显著性升高（P＜0.01），溃结灵中、高剂量组及SASP组血清中TNFα含量则显著性低于模型组(P＜0.05或P＜0.01)。
　　3 讨论
　　细胞因子在UC发病中的作用已得到公认，TNFα在多种细胞因子免疫网络中居重要地位，是目前已知的与炎症性肠病（IBD）发病关系最为密切的细胞因子。TNFα主要通过使中性粒细胞聚集、内皮粘附分子上调、凝血酶原效应等参与UC的发?Ｔ贗BD患者的血、粪便和肠组织中TNF水平均有所增加［7］。近年来抗TNFα单克隆抗体的应用已广泛开展，显示出较好的治疗效果。如Chey等［8］对16名UC难治病人使用Infliximab后，88%的病人临床症状、结肠镜及组织学得到改善。
　　近年研究认为NFκB的活化与细胞因子的调控关系密切。NFκB家族由5个成员构成，根据其跨域激活能力分为2组，第1组具有转录活性的有RelA(p65)、RelB和cRel，第2组不具有转录活性的有NFκB1（p50）和NFκB(p52），其中RelA(p65)具有显著的促炎活性［9］。NFκB广泛存在于各种组织中，能与许多细胞基因的启动子和增强子中的κB转录序列位发生特异性结合，参与包括IBD在内的多种炎症性疾病的发病，UC患者核内NFκB DNA结合活性明显升高［10-11］。对IBD起主要致病作用的细胞因子，如TNFα、IL1β、IL6、IL8等的转录水平由NFκB调控［12］。UC患者的NFκB已被活化并进入核内，具有很强的与基因κB位点相结合的能力，是细胞因子转录及释放的前提和关键。而且绝大多数细胞因子基因启动子或增强子部位均有NFκB结合位点，因此活化入核的NFκB即可与之结合并促进这些细胞因子的转录。研究发现在大鼠结肠上皮细胞培养基中加入IL1β和TNFα可激活核因子NFkB，进而可诱导编码IL1β、TNFα、IL6等细胞因子基因的表达，导致炎症反应的持续化［13］。
　　随着NFκB的深入研究，以此为靶标进行的IBD的治疗研究已成为当前研究的热点。一些NFκB抑制剂正处于临床或实验研究，如IL10可削弱TNFα诱导的IκB激酶（IKK）活性［14］，IL4可抑制NFκB的核转位［15］，抗氧化剂、蛋白酶体抑制剂也是抑制NFκB激活的一条非特异性途径，目前处于体外研究阶段。针对这一通路的基因治疗的研究也正在开展，特异性下调RelA表达的反义RNA的局部应用，可使实验性结肠炎获得组织学和症状上的缓解［15］。另外治疗IBD的传统药物SASP和类固醇都可通过抑制NFκB的活性，降低细胞因子的表达，这可能是两者抗炎活性的重要药理学机制［16-18］。
　　本研究采用TNBS法复制UC大鼠模型，给予不同剂量的溃结灵进行治疗，结果显示：UC模型大鼠血清TNFα的含量和结肠组织中NFκBp65阳性细胞表达率均显著性高于正常对照组，表明TNBS所致大鼠UC的发生与TNFα和NFκB的高表达密切相关；溃结灵中、高剂量组血清TNFα的含量显著性低于模型组，表明溃结灵有降低TNBS法UC大鼠模型血清中TNFα含量的作用；溃结灵中、高剂量组结肠组织中NFκBp65阳性细胞表达率显著性低于模型对照组，表明溃结灵对UC大鼠模型过度激活的NFκB有抑制作用。因此，溃结灵可能是通过抑制NFκB的活化，减少TNFα的释放而起到治疗UC的作用。其确切机制有待进一步研究。