亚砷酸对人肺腺癌细胞的体外抑制作用及机制分析

论文代写网： 　　　　　　作者：叶小卫，陈瑶，叶会丽，陈林香

【摘要】 【目的】探讨中药砒霜有效成分亚砷酸的体外抑瘤作用及机理。【方法】以体外培养的人肺腺癌细胞株（LAC）细胞为研究对象，选用对数生长期细胞，培养?24?h?后，分别加入不同浓度的亚砷酸（075、10、15、?20?mg／Ｌ)，并设模型对照组；采用倒置相差显微镜观察细胞形态，四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测LAC细胞的生长抑制率；酶联免疫吸附（ELISA）法检测p53基因的表达变化情况。【结果】各浓度亚砷酸均能使LAC细胞发生凋亡特征性形态改变，能显著性抑制LAC株的增殖，且呈现一定的时间效应关系，并能显著性升高p53基因的含量（均Ｐ＜００５或Ｐ＜００１）。【结论】亚砷酸抗肺癌的作用可能是通过上调p53基因的表达来诱导LAC肿瘤细胞凋亡，从而抑制LAC细胞的增殖，这可能也是中药砒霜能治疗肿瘤的机理之一。
【关键词】 砒霜／药理学；亚砷酸／药理学；肺肿瘤／中药疗法；细胞凋亡；细胞培养；基因表达调控
　　
　　【Methods】Human lung adenocarcinoma cells (LAC) at logarithmic growth phase were cultured in vitro for 24 hours，and then were cocultured with arsenic trioxide (AS2O3 ) in the dosages of 075，10，15 and 20?mg/L respectively.Meanwhile，model control group was set up.The morphological features of LAC in different groups were observed under reverse microscope，growthinhibitory rate of LAC was examined by methylthiazolyltetrazolium (MTT) assay，and the expression of p53 gene was detected by enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) method.
　　
　　【Results】AS2O3 in different dosages obviously inhibited the proliferation of LAC in a timeeffect manner，and markedly increased the expression of p53 gene （Ｐ＜００５ or Ｐ＜００１ compared with the model group）.
　　
　　【Conclusion】The therapeutic mechanism of arsenolitum for tumor may be associated with the inhibition of LAC proliferation by AS2O3 through upregulating p53 gene expression.
　　Key words：ARSENOLITUM/pharmacology；ARSENIC TRIOXIDE/pharmacology；LUNG NEOPLASMS/TCD therapy；CELL APOPTOSIS；CELL CULTURE；GENE EXPRESSION REGULATION
　　中药砒霜（三氧化二砷，AS２Ｏ３）及砷制剂对肿瘤的治疗是近年来的研究热点，特别是对白血病的治疗已为人们所关注。砷作为抗肿瘤药物在我国已有百年历史，中药传统方剂青黄散、十味丸等治疗不同类型的白血病确有一定疗效，经鉴定其中有效成分为含砷中药。近年来的实验与临床研究发现，三氧化二砷对肺癌有良好的抗肿瘤作用，其作用机制可能与诱导肿瘤细胞凋亡、抑制其增殖、逆转耐药等有关［1-5］，但其治疗肺癌的确切机理未完全阐明。近年来临床上将亚砷酸（化学成分：三氧化二砷）用于治疗肺癌已取得一定的效果，故本研究试图通过体外培养人肺腺癌细胞株（LAC）作为研究对象，观察亚砷酸对LAC细胞形态及p53基因表达的影响，以了解亚砷酸用于治疗肿瘤的机理。
　　
　　１材料和方法
　　11细胞株、药物与试剂LAC细胞株由广州军区总医院分子肿瘤学研究所细胞室提供；亚砷酸注射液，批号：19990191，由哈尔滨伊达药业有限公司生产；胎牛血清（FSC）为中国医学科学院血液学研究所产品；RPMI1640培养基、乙二胺四乙酸（EDTA）、胰蛋白酶、二甲基亚砜（DMSO）、四甲基偶氮唑盐（MTT）均为GIBCO公司产品；人p53定量酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒购自上海森雄科技实业有限公司。
　　12细胞培养将冻存的LAC株按常规方法复苏，接种于RPMI1640培养液（含体积分数为10％FSC、100?U/mL青霉素、100?mg/mL链霉素）中，于37℃、体积分数为5%CO2浓度及饱和湿度的恒温培养箱中培养，细胞呈单层贴壁生长，每?2～３?d?传代1次；传代时用?025?g／Ｌ?的胰蛋白酶和?02?g／Ｌ ＥＤＴＡ?消化?2～３?min，以培养液吹打制成细胞悬液，接种至?50?mL?培养瓶，至细胞生长旺盛后，取对数生长期细胞用于实验。
　　13细胞形态观察选用对数生长期细胞，用胰蛋白酶消化后，采用培养细胞计数法，用1640液稀释成2×105?/mL浓度的细胞悬液接种至50?mL培养瓶；置于37℃、体积分数为5％CO2及饱和温度的恒温培养箱中培养?24?h?后，实验组分别加入各种浓度（075、10、15、20?mg/L）的亚砷酸，模型组则加入不含药的细胞培养液。置于CO2培养箱中培养?48?h?、?72?h?后，将培养瓶置于倒置相差显微镜下进行细胞生长状态的观察。
　　14MTT比色法检测LAC肿瘤细胞的生长抑制率选用对数生长期细胞，用胰蛋白酶消化后，采用培养细胞计数法，用RPMI1640培养液稀释配成1×105个/mL的细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔接种100?μL，在ＣＯ２培养箱中培养?24?h?后，实验组加入不同浓度的亚砷酸（075、10、15、20?mg/L）100?μL，模型对照组则换含等体积溶剂的培养基，每组设16孔；每日更换新鲜培养液，以维持亚砷酸药液浓度不变；在ＣＯ２培养箱中培养?24、48、72?h?后每孔加入20?μL MTT无血清培养基，37℃继续培养?4?h?后，每孔加入100?μL DMSO，振荡混匀后，在酶标仪上检测492?nm处各孔吸光度（Ｄ）值，计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率：p抑制／%＝（1－Ｄ实验组／Ｄ模型组）×100％。
　　15人p53基因的检测选用对数生长期细胞，用胰蛋白酶消化后，采用培养细胞计数法，用1640培养液稀释成2×105/mL浓度的细胞悬液接种至50?mL培养瓶中；在ＣＯ2培养箱中培养?24?h?后，实验组分别加入各种浓度（075、10、15、20?mg/L）的亚砷酸，模型对照组则加入不含药的细胞培养液；置ＣＯ２培养箱中培养?48?h?后收集细胞，过滤后离心，吸取细胞培养上清液用于实验。按p53?ELISA试剂盒操作要求，依次加样、洗涤、孵育、洗涤，于酶标仪492?nm波长处比色。测定样品的吸光度值。
　　16统计学方法数据采用SPSS 100软件包处理。 转贴于 　　2结果
　　21形态学结果在倒置显微镜下可见各实验组中的细胞贴壁能力减弱，由贴壁生长而逐渐脱落，悬浮于培养液中，贴壁细胞数量减少，细胞形同变圆，部分细胞皱缩，体积缩小，出现核固缩，部分核碎裂。其中，尤以药物作用?72?h?、10?mg/L浓度组的形态改变最为明显。模型组中的细胞在镜下可见其贴壁生长良好，细胞轮廓清晰，细胞间结构紧密，细胞生长旺盛，几乎无脱落，胞浆饱满，相邻细胞生长致密，融合成片。结果见图1。
　　22MTT比色法检测结果表1结果表明，亚砷酸对人肺腺癌细胞株的增殖具有显著性抑制作用，且呈一定的时间依赖性，但与其药物浓度不成正比。
　　23人p53基因检测结果表2结果显示，不同浓度的亚砷酸作用于LAC?48?h?后，细胞培养上清液中的p53含量与模型组比较显著性升高（均Ｐ＜００5或Ｐ＜００１）。表明各浓度的亚砷酸均能上调LAC p53基因的表达。
　　表1各浓度亚砷酸对人肺腺癌细胞的抑制作用　略
　　图1培养?72?h?后各组细胞形态比较（略）
　　表2各浓度亚砷酸对人肺腺癌细胞p53基因表达的影响　略
　　3讨论
　　本实验以AS２Ｏ３作用于人肺腺癌细胞株，采用MTT比色法检测不同浓度AS２Ｏ３对LAC细胞抑瘤率的影响，ELISA法检测其作用LAC细胞?48?h?后对人p53基因表达的影响，以进一步探讨AS２Ｏ３对肺癌细胞的作用机理。肿瘤的特性之一是细胞周期异常，使肿瘤无限制地增殖，肿瘤治疗的中心环节是干扰肿瘤细胞的细胞周期，从而使肿瘤细胞增殖速率减慢或诱导细胞走向程序性死亡［6］。而细胞增殖、分化和凋亡是细胞生命活动中相互关联、相互影响的三种基本现象。细胞正常的增殖与分化、增殖与凋亡在机体内环境稳定中起着重要作用。细胞恶变被认为是增殖和分化两者平衡失调或偶联的解除，而细胞凋亡是一种内在基因调控，是维护内环境稳定的一种细胞自主性死亡过程。故细胞分化异常、增殖过度、凋亡受抑制等是肿瘤形成的基础。抑制增殖、诱导分化、降低恶性程度，促使肿瘤细胞死亡是肿瘤治疗的目的。抑癌基因p53位于人类第17号染色体短臂17P131位置，是一个公认的细胞凋亡诱导因子［7］。野生型p53基因的主要功能是整合细胞对各种危机状况，如物理或化学因素造成DNA损伤、缺氧等的反应，再通过p53蛋白的靶基因行使各项功能，例如通过靶基因p21及GADD45，调控细胞周期的G1、G2/M转换点，以维持基因组的遗传学稳定性；通过上调靶基因bax及IGFBP3，下调bcl2基因，促进细胞的凋亡。p53基因突变在人类许多常见肿瘤中均可检测到，包括肝癌、胃癌、大肠癌、食道癌、子宫癌、肺癌等，p53基因突变是不同类型肺癌中最常见的基因改变，且出现的频率比其他肿瘤要高得多。Takahashi等［8］发现小细胞肺癌（SCLC）中p53基因突变率最高，可达80%，非小细胞肺癌（NSCLC）中p53基因突变率也可达60%。本实验研究显示，经亚砷酸处理不同时间后，与模型组比较LAC肿瘤细胞在形态学上出现了凋亡特征性形态变化；MTT检测结果显示，亚砷酸对人肺腺癌细胞株（LAC）的增殖具有显著性抑制作用，且呈一定的时间依赖性，但与其药物浓度不成正比。通过检测经亚砷酸处理?48?h?后LAC细胞上清液p53基因的含量，结果提示，亚砷酸可上调p53基因的表达。因此，亚砷酸抗肺癌的作用可能是通过上调p53基因的表达来诱导LAC肿瘤细胞凋亡，从而抑制LAC细胞的增殖，这可能也是中药砒霜治疗肿瘤的机理之一。

参考文献

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　　［2］张炜煜，郭忠奎，王庆贵.三氧化二砷抗肿瘤的药理研究进展［J］.长春中医学院学报，2003，19（3）：118.

　　［3］王述民，马颖艳，刘锟.三氧化二砷诱导肺癌细胞凋亡的体外实验研究［J］.肿瘤防治研究，2001，28（4）：287.

　　［4］张曼颖，安继红，刘晓秋.三氧化二砷诱导肺癌细胞凋亡及对细胞周期的影响［J］.白求恩医科大学学报，2001，27（6）：626.

　　［5］吴广洲，郑世营，朱天忠，等.三氧化二砷逆转肺癌细胞株耐药的实验研究［J］.南通大学学报，2005，25（6）：424.

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　　［7］Cen G Q，Zu j，Si X G，et al.In vitro studies on cellular and molecular mechanisms of arsenic trioxide（AS2O3） induces NB4 cell apoptosis with downregulation of bcl2 expression and modulation of PRARα/P proteins［J］.Blood，1996，88（3）：1052.

　　［8］Takahashi T，Carbone D.Wildtype but not mutant p53 suppresses the growth of human lung cancer cells bearing multiple genetic lesions［J］.Cancer Res，1992，52：2340.转贴于