关于加味四逆散对心理应激损伤大鼠海马nNOS表达的影响

【摘要】 观察调肝治法方药--加味四逆散对慢性心理应激损伤大鼠海马神经元神经型一氧化氮合酶（nNOS）表达的影响。【方法】取Wistar大鼠24只随机分为3组：正常组（不施加任何刺激）、模型组（给予21d的随机应激刺激）、加味四逆散组（每次刺激前1h灌胃中药1次，剂量为3.38g/只）。正常组及模型组每次灌胃等容积生理盐水。采用免疫组织化学方法检测nNOS表达。【结果】3组大鼠海马的CA3区锥体细胞均有nNOS表达，而模型组表达的强度显著高于正常组，其阳性细胞数及阳性累积分显著性增多（Ｐ＜０.０１）；加味四逆散可显著性降低大鼠海马nNOS表达，减少其阳性细胞数及阳性累积分（Ｐ＜０.０１）。【结论】加味四逆散改善慢性心理应激的作用与其能抑制大鼠海马神经元nNOS的高表达，从而避免NO升高损害细胞有关。
【关键词】 加味四逆散／药理学 慢性心理应激／中药疗法 脑／酶学 疾病模型 动物 大鼠
　　心理应激是指由于个体在生活适应过程中的对环境要求与自身应付能力不平衡的认识所引起的一种身心紧张状态。心理应激可以通过感知、情感、行为和生理机制影响健康，机体的应激机制与许多疾病的发生、发展和转归有着密切的关系。研究发现，慢性应激作用下，海马神经元会发生萎缩、甚至死亡［1］。
　　一氧化氮（NO）在体内是一种含自由基的气体分子，易扩散，不稳定，过量的NO可生成毒性代谢产物而损害神经元［2］。本文采用免疫组织化学的方法观察调肝治法方药--加味四逆散对心理应激损伤大鼠海马神经型一氧化氮合酶（nNOS）表达的影响，探讨该方抗慢性心理应激海马NO损伤的相关机理。现将结果报道如下。
　　１ 材料与方法
　　1.1 动物 SPF级Wistar大鼠24只，雄性，体质量180～220g，由南方医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：2002-009。
　　1.2 药物 加味四逆散组成：柴胡5g，白芍15g，枳壳6g，枸杞子15g，山栀子5g，干地黄18g，石决明30g。药材由广州市药材公司提供，经药剂科鉴定均为纯正药材，常规煎煮取汁后浓缩至含生药1.69g/mL。药液常温冷却后，置4℃冰箱内保存备用。
　　1.3 主要试剂 即用型SP免疫组化试剂盒（ZYMED公司HISTMOUSETMSP系列，859643，购自晶美生物工程有限公司）；nNOS一抗、复合消化液（博士德公司，8BA0360）
　　1.4 仪器 三用电热恒温水浴箱（HHW21600，上海）；电热恒温鼓风干燥箱（DHG9070A型，深圳）；光学显微镜及摄像系统（OLYMPUS，1X71，日本）；超纯水机（NPG1020499，HUMAN CORPORATION，厦门）;制冰机（SANYO，SIM123，日本）；精密轮转切片机（RM2135）、染色机（ST4040）、石蜡包埋机（EG1160）、摊片机（HI1220）、展片机（HI1210）、脱水机（TP1020）均由德国LEICA公司提供。
　　1.5 动物分组及给药 大鼠随机分为3组：正常组（不施加任何刺激）、模型组（给予21d的随机应激刺激）、加味四逆散组（每次刺激前1h灌胃中药1次，剂量为3.38g/只），每组各8只。正常组及模型组每次灌胃等容积生理盐水。
　　1.6 慢性心理应激动物模型制备［3］ 电击足底（30V，电流强度1.0mA，每隔1min刺激1次，每次持续10s，共30次）、冰水游泳（4℃，5min）、夹尾（1min）、禁水（24h）、禁食（24h）、限制（2h）。以上应激刺激每天1种，随机安排在21d内，第22天取材。
　　1.7 标本的制备 用30g/L戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（50mg·kg-1），开胸经左心室插管至升主动脉，先用生理盐水200mL灌注，再用250mL含40g/L多聚甲醛的0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2～7.6）灌注，取脑，置于含40g/L多聚甲醛的0.01mol/L PBS中放置4～6h，常规石蜡包埋，切片，片厚4μm。
　　1.8 检测方法 采用免疫组织化学法检测大鼠海马nNOS：（1）切片脱蜡、水化，PBS洗2min×3次；（2）蒸馏水新鲜配置体积分数为3%h3O2，室温放置5～10min以灭活内源性酶，蒸馏水洗5min×3次；（3）滴加复合消化液，37℃作用5～10min，蒸馏水洗5min×3次；（4）滴加体积分数5%血清封闭液，室温20min，甩去多余液体，不洗；（5）滴加一抗（1：200）4℃过夜，PBS洗涤2min×3次；（6）滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，37℃作用20min，PBS洗涤2min×3次；（7）滴加试剂链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（SABC），37℃作用20min，PBS洗涤5min×4次；（8）联苯二胺（DAB）显色：使用DAB显色试剂盒。取1mL蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各1滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下观察控制反应时间5～30min，自来水洗涤，蒸馏水洗涤；（9）苏木素轻度复染，脱水，透明；（10）封片胶（中性树脂）封片，干燥后显微镜下观察结果。
　　试验中设立严格的阴性对照（以PBS缓冲液代替一抗）。每只大鼠选取2张切片，每张切片选取1个固定的高倍视野（40×10倍），以两种方法处理结果［4］：（1）记数阳性细胞和神经细胞的总数，计算阳性细胞所占的百分率；（2）采用半定量方法，分别按阳性细胞的分布和染色深度记分，计数阳性累积分。阳性细胞的分布记分标准：０分：无着色细胞；１分：阳性细胞数少于整个组织细胞数的１／２；２分：阳性细胞数介于整个组织细胞数的１／２～2/3；3分：超过整个组织细胞数的２／３。染色深度记分标准：０分：不着色；１分：介于０分和２分之间（棕色）；２分：深染（褐色）。以２者相加分数作为阳性累积分，计算出平均值。
　　1.9 统计学方法 采用SPSS 11.0统计软件包进行方差分析。
　　2 结果
　　各组大鼠海马nNOS的表达见表1和图1。结果可以看出，nNOS散在分布于正常组大鼠海马的各个区域，胞体主要呈圆形或椭圆形、梭形等多种形态，但阳性细胞数不多。与正常组相比，模型组海马内nNOS表达强度显著高于正常组，阳性细胞数及阳性累积分显著增多（Ｐ＜０.０１）。加味四逆散组与正常组比较无显著性差异（Ｐ＞０.０５）;与模型组比较，海马内nNOS表达显著性降低，阳性细胞数及阳性累积分显著性减少（均Ｐ＜０.０１）。表1 各组大鼠海马nNOS的表达结果
　　3 讨论
　　NO具有双重作用。生理范围的NO对机体有益，可参与中枢神经系统的信息传递；当机体内合成过量的NO会引起神经毒性作用［2］。
　　在NO的生物合成中，NOS起着关键性作用。它是一种同源二聚体，由两个单体在细胞色素和细胞色素还原酶的作用下聚合而成。NOS是一组同工酶，根据酶的来源、对Ca2＋/CaM依赖性的不同，以及是否受内毒素、细胞因子诱导等特点，一般将NOS分成神经型NOS（neuronal NOS，nNOS）或Ⅰ型NOS、巨噬细胞型NOS（isoforms NOS，iNOS，又称免疫型）或Ⅱ型NOS、内皮型NOS（endothelial NOS，eNOS）或Ⅲ型NOS。nNOS和eNOS为Ca2＋/CaM依赖型，二者又合称原生型NOS（constitutive NOS，cNOS）。nNOS主要分布于神经元，在一些非神经组织中也有表达，与突触可塑性、神经再生、神经传导及神经元的发育、神经内分泌的调节等多种中枢神经系统生理功能相关［5］。
　　对慢性心理应激损伤引起的NO含量升高的机制尚未完全清楚。兴奋性氨基酸谷氨酸（Glu）可能在NO含量升高中起重要作用。慢性应激时下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴活动亢进、血浆糖皮质激素（GC）浓度升高，高浓度的GC可引起Glu过多释放，造成细胞外Glu堆积［6-10］。Glu与突触后膜N甲基D天（门）冬氨酸（NMDA）受体结合，引起神经元持续去极化，导致离子渗透压力和电化学改变，Ca2+通过电压依赖性钙通道或NMDA受体联结的通道内流，使细胞内Ca2+增加；Ca2+与CaM偶联并结合于胞浆中NOS相应的位点上激活NOS；后者催化NO的生成［11］。升高的NO一方面直接通过其代谢产物过氧亚硝酸盐阴离子（ONOO－）抑制Glu的摄取［12-13］，加重细胞外Glu堆积；另一方面又作为逆行信使再扩散到突触前膜，与细胞内可溶性鸟苷酸环化酶活性中心的Fe2+结合，改变酶的立体构型，导致酶的活性中心增强和环磷酸鸟苷（cGMP）合成增多，通过cGMP进一步促进Glu的释放，最终也导致Glu水平显著升高［14］。慢性应激可能通过NO与Glu这种互为因果的关系，形成一个Leza等［15］提出的GluNOGlu正反馈环路，不断放大毒性分子的效应［16］。
　　我们的观察结果表明，3组大鼠海马的CA3区锥体细胞均有nNOS表达，而模型组表达的强度显著高于正常组和加味四逆散组。正常组有nNOS表达，表明生 理状态下海马CA3区锥体细胞也有nNOS的表达，很可能正是由于这种表达保证了低浓度NO的存在，以维持神经元的兴奋性和促进突触传递的长时程增强（LTP）的形成［15-16］。模型组nNOS表达增强可能是慢性应激引起NO生成过多的原因之一。加味四逆散组nNOS表达与模型组比较显著性降低，表明调肝治法方药可以抑制慢性应激引起的nNOS表达，从而避免NO升高损害锥体细胞。与Gould等［17］认为海马各亚区锥体细胞均有nNOS表达，但CA3区和门区中间神经元nNOS mRNA表达的变化与慢性应激引起海马CA3区神经元的损伤有关的结论相符。其确切机制有待进一步研究。

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