CIAPIN1在人肺癌组织中的表达及其对人小细胞肺癌NCIH446细胞生长的影响

【摘要】 目的: 探讨新基因CIAPIN1在人肺癌和癌旁正常组织中的表达差异及该基因导入对人小细胞肺癌NCIH446细胞生长的调控作用。方法: 采用免疫组化方法检测51例石蜡包埋的肺癌及癌旁正常肺组织中CIAPIN1蛋白的表达; 构建腺病毒载体介导CIAPIN1基因(AdCIAPIN1)， 转染到自身CIAPIN1低表达的人小细胞肺癌细胞系NCIH446， Western blot 检测目的蛋白的表达; 台盼蓝染色计数活细胞数， 绘制细胞生长曲线; 流式细胞术(FCM)分析细胞周期及细胞凋亡的变化。结果: 癌旁正常肺组织中CIAPIN1基因蛋白阳性表达率（100%）明显高于肺癌组织中表达率（39.2%， P&<0.05）; 与对照组相比， 腺病毒介导的CIAPIN1实验组能迅速抑制NCIH446细胞的生长(P&<0.01)， 诱导细胞发生凋亡， 并出现明显的G1/S期阻滞现象。结论: 肺癌组织中CIAPIN1基因表达下调可能与肺癌发生密切相关， AdCIAPIN1转染NCIH446细胞能明显抑制肿瘤细胞的生长， 提示CIAPIN1基因可能是一个新的抑癌相关基因。

【关键词】 CIAPIN1基因 腺病毒 肺癌 细胞凋亡 抑制

　　CIAPIN1 (cytokine induced apoptosis inhibitor 1)， 又称anamorsin， 一个最新被证实和凋亡相关的分子， 其基因定位于16号染色体长臂。Shibayama等［1， 2］最早证实CIAPIN1是独立于凋亡调节分子Bcl2家族、 caspase家族等之外的RAS信号转导通路中的一个新调节分子。新近研究发现， CIAPIN1广泛分布于胎儿和成人的正常组织中， 特别是在分化型组织和活性代谢组织中具有高表达［3］， 但是在某些癌症发生时表达受抑［4］， 提示CIAPIN1基因的表达与肿瘤的发生发展有密切联系。腺病毒作为目的基因转移的载体， 具有安全、 宿主细胞广泛、 感染靶细胞效率高、 制备和转导方便等优点， 而且由于腺病毒亲肺部的特性， 腺病毒广泛用于肺部疾病的治疗［5， 6］。本实验针对小细胞肺癌基因治疗研究的特点， 首先从组织水平研究CIAPIN1表达与人肺癌发生的关系; 其次在构建腺病毒载体介导的CIAPIN1基因(AdCIAPIN1)转染人小细胞肺癌细胞系NCIH446中， 进一步观察其对肺癌细胞生长、 细胞周期及凋亡的影响。为研究CIAPIN1基因表达变化在小细胞肺癌中的作用及其效应机制提供实验依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　NCIH446: 人小细胞肺癌细胞系， 由本室保存; 胎牛血清购自Sigma公司; RPMI1640、 DMEM培养基干粉购自Gibco公司。免疫组化SABC试剂盒购自博士德生物工程有限公司。全组共51例石蜡包埋肺癌组织及相应癌旁正常肺组织标本， 来自第四军医大学唐都医院胸外科2005-10/2007-06经病理证实的手术病例。其中鳞癌20例， 腺癌20例， 小细胞肺癌11例; 年龄39～78岁(男35例， 女16例)。取标本前所有病例均未行放疗、 化疗和生物反应调节剂治疗。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养和传代

　　NCIH446培养条件: 在37℃、 50 mL/L CO2培养箱中， 用含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液培养（青霉素和链霉素各100 U/mL）; 2.5 g/L胰蛋白酶消化传代。293细胞: 腺病毒E1基因转化的人胚肾细胞系。培养条件: 37℃、 50 mL/L CO2培养箱中， 用含100 mL/L 胎牛血清的DMEM培养液培养。

　　1.2.2 免疫组化SABC方法

　　采用SABC免疫组化法进行分析， 试验所用载玻片均经PolyLysine防脱片剂处理。抗原修复方法为微波炉加热0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液至沸腾， 然后放入切片， 95℃加热5 min， 断电后等缓冲液自然冷却至室温后再取出切片， PBS液冲洗3次，
每次2 min。以郝志强等纯化的小鼠CIAPIN1蛋白的单克隆抗体（mAb）作为一抗， 稀释度为1∶2 000， 生物素化山羊抗小鼠IgG作为二抗， 稀释度为1∶500， CIAPIN1已染出的胃癌切片做阳性对照。以0.01 mol/L PBS代替一抗作为阴性对照。判定标准: 阳性显色为肿瘤细胞核和(或)胞质被染成褐黄色、 呈现粗细不等、 深浅不一的颗粒状。CIAPIN1蛋白阳性细胞分为3级: CIAPIN1 (-): 癌细胞无着色， CIAPIN1 (+): 癌细胞核呈棕色颗粒状， 着色癌细胞核所占比例&<25% ， CIAPIN1 (): 着色细胞核呈棕色颗粒状， 数量≥25%。

　　1.2.3 重组腺病毒的构建和基因转染

　　重组CIAPIN1基因的腺病毒AdCIAPIN1及用作对照的GFP重组体腺病毒AdEGFP由本研究组李晓华博士构建［4］， 均为复制缺陷型腺病毒。在293细胞中进行扩增繁殖及纯化后， 采用Qbiogene公司的 TCID50法测定病毒滴度。用含100 mL/L甘油的保存液于-80℃保存。

　　1.2.4 重组体腺病毒转导效率的检测

　　以AdEGFP为代表， 按不同的感染复数MOI(multiplicity of infection) 转染NCIH446细胞。48 h后， 弃去培养液， 用40 g/L甲醛固定6～8 h后， 加入Xgal 染液［1 g/L Xgal液于0.1 mol/L PBS中， 1.3 mmol/L MgCl2， 3 mmol/L
K3Fe(CN)6， 3 mmol/L K4Fe(CN)6］， 于37℃放置过夜后， 计数蓝色细胞的百分率。

　　1.2.5 外源性CIAPIN1基因在NCIH446中表达测定

　　外源性CIAPIN1基因转染NCIH446细胞24 h后收集细胞， 用细胞裂解液裂解， 取30 μg细胞总蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳， 按半干转法将电泳产物转移到PVDF膜， 50 g/L脱脂奶粉封闭1 h， 滴加一抗CIAPIN1 (1∶2 000) 4℃过夜， TBST洗膜10 min×4次， 滴加二抗(1∶500)， 37℃孵育2 h， TBST洗膜， 按ECL试剂盒说明进行显色， GelDoc凝胶成像仪采集图像
， 以空白对照和AdEGFP代替一抗为阴性对照。

　　1.2.6 细胞生长曲线测定

　　实验分为3组: 以转染AdCIAPIN1的NCIH446细胞为病毒实验组， 以转染AdEGFP 的NCIH446细胞为病毒对照组及未经任何病毒处理的空白对照组。各实验组以3×105/L细胞接种于6孔板， 每孔2 mL， 12 h后在37℃、 无血清培养基中按MOI=30转染重
组腺病毒AdCIAPIN1培养4 h。转染细胞在含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液中连续培养5 d。每日定时消化收集各组细胞， 5 g/L台盼蓝染色， 显微镜下计数活细胞。三组同步培养， 每组于每个时间点分别设3个复孔（n=3）， 绘制细胞生长曲线。

　　1.2.7 流式细胞术（FCM）分析

　　定时收集各组细胞， 700 mL/L乙醇4℃ 固定3 h， PBS洗2次。加RNase(终浓度50 mg/L) 37％消化30 min， 碘化丙啶(PI， 终浓度50 mg/L) 4℃避光染色30 min， 用FCM检测。细胞周期分析采用美国Becton．Diekinson公司的Cell Quit Plot分析软
件。

　　1.2.8 统计学处理

　　采用SPSS10.0分析数据， 两两比较采用Student’s t检验， 以P＜0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 CIAPIN1在肺癌组织和癌旁正常组织中的表达

　　CIAPIN1基因蛋白表达CIAPIN1阳性染色主要位于细胞质和胞核中， 呈清晰棕黄色弥漫性分布表达， 部分可见明显颗粒状着色。在51例癌旁正常肺组织中， CIAPIN1阳性染色均呈阳性（100%）， 在51例肺癌组织中， 20例阳性（39.2%）， 31例阴性（阴性率60.8%）。其中， 鳞状上皮癌20例中， 13例阴性（65%）; 腺癌20例， 11例阴性（55%）; 小细胞癌11例， 7例阴性（63.6%）(图1)。

　　2.2 重组体腺病毒的转导效率

　　转染AdEGFP的NCIH446细胞， 48 h后用Xgal溶液染色， 结果发现， 当MOI≥30时， 100％的细胞蓝染。说明重组体腺病毒对NCIH446细胞具有较高的转导效率。

　　2.3 重组体腺病毒介导外源性CIAPIN1基因的表达

　　提取经AdCIAPIN1转染3～4 d的NCIH446细胞总蛋白质， 用鼠抗人CIAPIN1蛋白抗体进行Western blot分析， 用空白对照组和经AdEGFP转染3～4 d的NCIH446细胞做阴性对照。结果显示(图2)， NCIH446细胞低内源性CIAPIN1蛋白表达， 腺病毒能介导外源性CIAPIN1基因在NCIH446细胞中高效表达。

　　2.4 腺病毒介导CIAPIN1基因对肿瘤细胞NCIH446的抑制作用

　　以MOI=60转染AdCIAPIN1或AdEGFP的细胞与未转染病毒的空白对照组细胞同步培养， 每日定时观察细胞生长状况。与后二者对照组相比， 实验组细胞在转染AdCIAPIN1后第2天即开始出现生长抑制现象， 细胞数量减少， 细胞变圆， 胞质出现空泡， 细胞膜突起或内陷聚集成团， 最终脱落浮起而死亡。通过每日定时收集细胞、 台盼蓝染色、 计数活细胞的方法， 绘制细胞生长曲线(图3)， 结果可见腺病毒介导CIAPIN1蛋白在NCIH446细胞内的表达， 明显抑制肿瘤细胞NCIH446的生长(P&<0.01)。而2个对照组中， 转染AdEGFP的细胞生长曲线基本与未转染病毒的NCIH446细胞空白对照组接近(P&>0.05)。

　　2.5 AdCIAPIN1对NCIH446细胞周期的阻滞作用

　　对实验组、 病毒对照组和空白对照组细胞的细胞周期进行FCM分析， 发现实验组细胞在转染AdCIAPIN1重组腺病毒后， G0/G1期细胞比例（80.3%）明显高于病毒对照组(66.59%)和空白对照组细胞比例 (63.02%)， S期细胞比例（9.45%）明显低于病毒对照组(18.46%)和空白对照组细胞比例（21.19%）(图4)。细胞G0/G1期比例增加， S期和G2M期比例下降， 并有凋亡现象产生， 说明CIAPIN1基因能引起G1/S期阻滞， 抑制人小细胞肺癌细胞的增殖。而同期培养的两组对照细胞均未出现明显的细胞周期阻滞和
细胞凋亡的现象。

　　3 讨论

　　CIAPIN1基因是一个新近证实与凋亡相关的分子， 定位于16号染色体长臂(16q1.32.1)， Mr为39 000。 新近研究在成功制备了CIAPIN1的mAb工作基础上［7］， 发现CIAPIN1广泛分布于胎儿和成人的各种正常组织中， 但表达水平在组织间有差异；确定了CIAPIN1的亚细胞定位为胞质、胞核， 浓集于核仁［8］; 对细胞的增殖及分化具有重要的调控作用， 在某些癌症发生时表达异常；提示CIAPIN1基因的表达与肿瘤的发生发展有密切联系。

　　本研究中收集了51例新鲜肺癌及其癌旁正常肺组织标本， 其中鳞癌20例， 腺癌20例， 小细胞肺癌11例。采用我校消化疾病中心研制的抗人CIAPIN1mAb， 通过免疫组化方法发现上述肺癌组织中CIAPIN1基因表达明显下调。在51例癌旁正常肺组织中， CIAPIN1阳性染色均呈阳性（100%）；而在51例肺癌组织中， CIAPIN1 的表达阳性率仅为39.2 %。初步揭示肺癌组织中CIAPIN1基因表达下调与肺癌发生密切相关。为了进一步研究该基因与肺恶性肿瘤的关系， 择取经Western blot证实的CIAPIN1低水平表达的小细胞肺癌细胞系NCIH446， 在成功构建AdCIAPIN1重组腺病毒的基础上， 以MOI=60转染小细胞肺癌NCIH446细胞并获得目的基因的高表达后观察AdCIAPIN1对癌细胞生长、 细胞周期及凋亡的影响。结果发现目的基因转染后自第2天起， 肿瘤细胞生长即受到抑制， 第5天时抑制水平较对照组已有非常明显的差异(P&<0.01)。表现为细胞数量减少， 细胞变圆， 胞质出现空泡， 细胞膜突起或内陷聚集成团， 最终脱落浮起而死亡。而同期培养的转染了对照腺病毒Ad
EGFP的细胞和未转染病毒的空白对照组细胞， 生长状态良好。从细胞生长曲线上看， 病毒实验组细胞生长完全被抑制， 而对照组的腺癌细胞数量随培养时间延长有明显的增加。另外， 转染AdEGFP的病毒对照组细胞生长曲线要低于空白对照组， 这可能是细胞在转染后表达所表现出的毒性反应。进一步采用FCM分析病毒实验组的细胞周期后发现， NCIH446细胞转染CIAPIN1基因后， 早期即出现明显的G1/S期阻滞，随后并伴有肿瘤细胞的凋亡。因此可以肯定， CIAPIN1基因表达具有抑制人小细胞肺癌的生长， 促进细胞周期G1/S期阻滞， 诱导癌细胞凋亡
等作用。

　　综上所述， 实验发现并初步证实CIAPIN1基因可能是一个新的抑癌相关基因。该新基因表达下调与肺肿瘤细胞发生有密切联系；并对肿瘤细胞具有明显的抑制作用， 其效应环节可能是通过肿瘤细胞周期的G1/S阻滞来实现的， 这在国内外肺癌研究中尚未见报道。CIAPIN1基因对肺肿瘤细胞周期调控和引起细胞凋亡作用的确切分子机制值得深入探讨。

参考文献

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