和厚朴酚对肝癌HepG2细胞生长抑制及凋亡的作用

　　　　 作者：顾伟， 范昕建*， 吴疆， 张莉敏， 李晓芳， 牛智强

【摘要】 　　目的: 研究和厚朴酚(honokiol)对人肝癌HepG2细胞增殖的影响及诱导凋亡作用。方法: 用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测不同浓度和厚朴酚对HepG2细胞的增殖活性的效应， 通过显微镜、 荧光染色观察细胞形态学变化; DNA片段化检测细胞凋亡; 流式细胞术检测和厚朴酚诱导细胞凋亡的凋亡指数(AI)， caspase3、 8、 9活性的变化。结果: 和厚朴酚浓度为40～160 μmol/L时对HepG2细胞增殖有明显的抑制效应， 且呈剂量依赖性; 细胞加入和厚朴酚诱导24 h后AI明显高于未加入组(P&<0.05)， caspase3、 8、 9活性增高。结论: 和厚朴酚在一定浓度范围内能明显抑制HepG2细胞的增殖并能诱导其凋亡， 其作用呈浓度依赖性。它可能通过激活caspase途径诱导HepG2细胞凋亡。

【关键词】 和厚朴酚 HepG2细胞 增殖 生长抑制 凋亡

　　传统中药厚朴被广泛使用于治疗许多疾病， 和厚朴酚(honokiol)是木兰科植物厚朴(Magnolia officinalis)的有效成分， 是一种从中药厚朴中分离出来的具有生物活性的化合物， 据文献报道和厚朴酚具有抗氧化、 抗血栓形成、 抗菌、 和抗肿瘤［1-4］的作用。本研究观察了和厚朴酚对HepG2细胞增殖的影响及其诱导HepG2细胞凋亡的作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 流式细胞仪(EPICS ELITE ESP， Beckman Coulter)， 二氧化碳(CO2)培养箱(SANYO)， 倒置生物显微镜(Olympus)， 凝胶成像系统(Gel Doc 1000， BIORAD)， 24、 96孔培养板(Corning Incorporated)， DMEM培养基(Gibco， Grand Island， NY， USA)， 小牛血清购于兰州民海生物有限公司。Hoechest33258、 Annexin VFIFC细胞凋亡检测试剂盒购于凯基生物科技发展有限公司。琼脂糖， 溴化乙锭(EB)， 甲基噻唑蓝(MTT)， 二甲基亚砜(DMSO)购于Sigma (St. Louis， MO， USA)和厚朴酚(honokiol)标准品购于中国药品生物制品检定所， 用二甲基亚砜溶解(DMSO)(终浓度&<0.01%)。人肝细胞癌细胞株HepG2， 来自ATCC，四川大学教育部移植免疫重点实验室细胞室保种。细胞接种在含100 mL/L小牛血清的DMEM培养液中， 在37℃、 50 mL/L CO2培养箱中培养。

　　1.2 方法

　　1.2.1 MTT 法检测 取对数生长期人肝细胞癌细胞株HepG2， 加入2.5 g/L胰蛋白酶消化， 吹打制成单个细胞悬液， 调整细胞密度为5×103/L， 以每孔体积200 μL接种于96孔培养板上。培养24 h， 待细胞贴壁后， 各孔分别加入不同浓度的和厚朴酚， 每孔体积均为200 μL， 使和厚朴酚终浓度分别为0(对照组)、 20、 40、 80、 160 μmol/L(用药组)， 每个浓度作3个复孔， 同时点3块板。分别培养24、 48、 72 h后， 加入MTT20 μL/孔， 置于CO2培养箱中继续培养4 h后终止培养。小心吸弃孔内培养上清液， 每孔加入DMSO150 μL， 充分振荡， 使蓝紫色沉淀充分溶解。在30 min内用酶联免疫检测仪测定570 nm波长处的光吸收值A570 。不同时间点不同浓度和厚朴酚对肝癌细胞的增殖抑制率=(对照组A570－用药组A570)/对照组A570×100%。

　　1.2.2 形态学的观察 每瓶1×106个细胞的密度接种于50 mL 细胞培养瓶中， 培养24 h后加入浓度为0和40 μmol/L的和厚朴酚， 于24 h用倒置显微镜观察。

　　1.2.3 荧光染色 每瓶1×105个细胞的密度接种于24孔培养板中， 24 h后加入浓度为0和40 μmol/L的和厚朴酚， 培养24 h， 细胞在24孔培养板内原位固定染色。用磷酸盐缓冲液(PBS)洗1次， 用40 g/L多聚甲醛500 μL室温固定15 min， 用PBS洗2次， 弃废液， 加入终浓度为10 mg/L， Hoechst 33258溶液500 μL/孔， 37℃染色10 min， 荧光显微镜下观察。

　　1.2.4 DNA片段化电泳 收集1×106以上的细胞， 用PBS洗2次， 加入100 μL细胞裂解液(10 mmol/L TrisHCl pH7.4， 10 mmol/L EDTA pH8.0， 5 mL/L Triton X100) 4℃裂解10 min， 25000 g离心20 min， 收集上清液。加入40 ng/L RNase， 37℃孵育1 h后加入40 ng/L蛋白酶K， 37℃孵育1 h， 加入20 μL5 mol/L NaCl和120 μL异丙醇， -20℃过夜。25000 g离心15 min， 去上清， 再次25000 g离心5 min， 去上清， 用TrisEDTA(pH7.5)缓冲液溶解沉淀。用20 g/L琼脂糖凝胶40V电泳， 4h， 0.5mg/L溴化乙锭染色后紫外灯下观察。

　　1.2.5 磷脂酰丝氨酸外翻分析法(AnnexinV法) 每瓶1×106个细胞的密度接种在50 mL细胞培养瓶中， 培养24 h后， 加入浓度为0(对照组)、 20、 40、 80、 160 μmol/L(用药组)和厚朴酚， 培养24 h后， 用2.5 g/L胰蛋白酶消化细胞， 制成单个细胞悬液， 收集1×106以上个细胞， 用PBS离心洗涤， 加入500 μL Binding Buffer和FITC标记的膜联蛋白V(AnnexinV) 5 μL 和5 μL碘化丙啶(propidium iodide， PI)在4℃反应30 min， 上流式细胞仪检测， 光源为488 nm。

　　1.2.6 caspase3、 8、 9检测 每瓶1×106个细胞接种在75 mL 细胞培养瓶中， 培养48 h， 计数， 每瓶约3×106个细胞，加入浓度为40 μmol/L和厚朴酚分别在0、 2、 4、 8、 16、 24 h 用南京凯基生物公司caspase3、 8、 9分光光度法检测试剂盒检测caspase的活化程度， 具体过程按试剂盒说明完成， 用酶标仪测定405 nm波长处的光吸收A值。

　　1.2.7 统计学处理 各组数据经SPSS12.0统计软件进行统计分析， 数据用x±s表示， 两组均数比较用小样本t检验， P&<0.05 为具有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 对人肝癌HepG2细胞增殖的影响 不同浓度的和厚朴酚在不同时间对人肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用详见表1。结果显示， 20 μmol/L低浓度的和厚朴酚对HepG2细胞抑制作用较小， 40 μmol/L中浓度的和厚朴酚对HepG2细胞的抑制作用与80 μmol/L的和厚朴酚接近。当和厚朴酚的浓度在40～80 μmol/L范围时呈现出以下特点: 从24 h开始， 不同浓度的和厚朴酚即对HepG2细胞的增殖表现出不同程度的抑制作用， 到72 h最大抑制率达93.79%。统计学分析显示， 与对照组比较， 用药组各时间点抑制率均具有统计学意义(P&<0.01)。和厚朴酚对HepG2细胞的抑制作用呈浓度依赖关系， 随和厚朴酚浓度增加而增加。按照细胞存活率对剂量对数作图并按作图法求出药物半数抑制浓度(IC50)值为33～83（图1）。

　　表1 和厚朴酚不同浓度对人肝癌HepG2细胞的增殖抑制率（略）

　　aP&<0.05 vs 对照组.

　　图1 不同浓度和厚朴酚作用HepG2细胞培养24 h、 48 h和72 h后的细胞增殖抑制情况（略）

　　2.2 和厚朴酚诱导HepG2细胞形态学变化 40 μmol/L和厚朴酚作用于HepG2细胞24 h后， 细胞变圆， 膜皱缩， 细胞表面产生许多泡状(图2) 。通过Hoechst 33258荧光染色法发现未经药物处理细胞核表面光滑， 发出的荧光均匀， 药物处理后细胞核皱缩， 发出致密的荧光， 细胞核裂解为碎块， 出现圆形小体(图3)。

　　图2 不同浓度和厚朴酚对HepG2作用24 h后倒置显微镜下形态变化（×200）（略）

　　A: 0 μmol/L和厚朴酚对HepG2作用24 h. 可见细胞表面光滑，形态规整; B: 40 μmol/L和厚朴酚对HepG2作用24 h. 可见细胞变圆， 膜皱缩， 表面产生许多泡状.

　　图3 用Hoechst 33258染色后观察不同浓度和厚朴酚对HepG2作用24 h后形态变化（×200）（略）

　　A: 0 μmol/L和厚朴酚对HepG2作用24 h. 细胞形态光滑， 荧光均匀; B: 40 μmol/L和厚朴酚对HepG2作用24 h. 细胞核皱缩， 发出致密的荧光， 细胞核裂解为碎块， 出现圆形小体.

　　2.3 DNA电泳观察 细胞发生凋亡时主要的生化标志是其染色质发生浓缩，染色质DNA被核酸内切酶在核小体单位之间降解， 断裂为180～200 bp的片段， 在凝胶电泳上表现出梯状DNA区带图谱。40 μmol/L和厚朴酚作用于HepG2细胞24 h后即发生明显的DNA片段化(图 4)。

　　图4 不同浓度和厚朴酚对HepG2作用24 h后的DNA ladder（略）

　　M: DNA marker; 1: 0 μmol/L; 2: 20 μmol/L; 3: 40 μmol/L.

　　2.4 磷脂酰丝氨酸外翻分析 为了定量检测凋亡细胞， 我们将标记了荧光标记蛋白的膜联蛋白V和PI与培养基孵育(图5)。在图象的的右下脚为膜联蛋白V阳性而PI阴性的细胞， 表明细胞处于凋亡早期; 膜联蛋白V和IP都阴性的细胞(图象的左下角)为正常存活的细胞。膜联蛋白V阴性而PI阳性的细胞(图象的左上角)为坏死或凋亡晚期的细胞。20 μmol/L 组早期凋亡率为15%， 40 μmol/L组为31%， 80μmol/L组为25%， 160μmol/L组为9.8%明显高于0μmol/L组为0.1%。P&<0.05有统计学意义。

　　图5 磷脂酰丝氨酸外翻分析不同浓度和厚朴酚作用HepG2细胞24 h后的凋亡率（略）

　　2.5 caspase3、 8、 9活性的检测的观察 在和厚朴酚诱导HepG2细胞凋亡过程中caspase3、 caspase8、 caspase9蛋白酶活性呈时间依赖性增高， caspase9在2 h开始超高， caspase3在4 h开始升高， 两者都在16 h达到最高; caspase8在4 h开始升高， 在24 h达到最高(P&<0.01， 图6)。

　　图6 和厚朴酚作用HepG2细胞不同时间caspase3、 8、 9活性变化（略）

　　40 μmol/L和厚朴酚诱导HepG2细胞一个时间段， 分别检测caspas3、 8、 9的活性.

　　3 讨论
　　
　　近年来， 从天然药物中寻找安全有效的肿瘤化疗替代药物成为研究的热点之一。本研究中和厚朴酚对人肝癌HepG2细胞具有明显的细胞毒作用， 形态学和DNA片段化电泳及磷脂酰丝氨酸外翻分析法(AnnexinV法)流式细胞术检测结果表明和厚朴酚是通过诱导肿瘤细胞凋亡发挥其细胞毒作用的。在AnnexinV法中， 随着和厚朴酚浓度的增加， 使细胞的凋亡率增加， 但在160 μmol/L浓度时， 凋亡率反而下降， 这可能跟药物的浓度增高， 在高浓度和厚朴酚的作用下， 坏死细胞和凋亡晚期细胞增多， 故凋亡早、 中期细胞反而降低。
　　
　　细胞凋亡过程中caspase家族的激活起着关键的作用［5］在细胞凋亡的信号传递中， caspase处于凋亡诱导信号传递、 caspase级联反应、 下游效应因子作用这一凋亡过程中的中心位置［6］目前发现启动caspase， 如aspase8， 9和效应caspase， 如caspase3， 7两类; 分别参与凋亡的启动和执行过程［7］。而caspase9主要参与诱导线粒体损伤介导细胞凋亡的途径［8］。caspase3被称为“执行者”， caspase8和9被称为“发起者”［9］。caspase8和caspase9直接或间接激活下游的效应分子caspase3， 6， 7再激活核酸内切酶， 导致DNA片段化。在和厚朴酚诱导HepG2细胞凋亡过程中我们检测了3种caspase蛋白酶活性均呈时间依赖性增高， 其中以caspase9和caspase3蛋白酶活性升高显著。其中， caspase9活性最早升高， 在和厚朴酚作用2 h后开始升高， caspase3活性在和厚朴酚作用4 h后开始升高， 说明caspase9在细胞凋亡中首先启动， 后caspase3做为执行者， 在凋亡过程中起到重要作用。caspase8活性在4 h开始增高， 说明死亡受体(TNF FasL)介导细胞凋亡的途径也参加了凋亡的过程。表明和厚朴酚诱导HepG2细胞凋亡可能主要是与通过损伤线粒体从而活化caspase3， 8， 9途径启动的caspase级联反应有关。穆红等［10］采用能激活caspas3和含有p53cDNA的真核表达质粒p53pcDNA3对人源性肝癌细胞系HepG2进行转染， 导入的p532cDNA可诱导HepG2细胞发生凋亡， 与本实验caspas3在4 h开始升高， 后达高峰， 说明caspas3被激活后作为促使HepG2发生凋亡的主要原因。这对寻找到更好的天然诱导药物， 以促进肝细胞凋亡， 提高肝癌治疗疗效有一定的意义。

参考文献

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