黑色素瘤抗原MAGEA9基因在真核细胞中的表达研究

　　　　 作者：于智勇， 薛庆於， 沈维干

【摘要】 　　目的: 克隆MAGEA9基因并对其进行真核表达及鉴定。方法: 通过逆转录多聚酶链式反应(RTPCR)从原发性肝癌的细胞中扩增MAGEA9基因片段， 将该片段克隆在真核表达载体pEGFPC3中， 转染NIH3T3细胞， 经G418筛选， 构建稳定表达细胞系， 并用荧光显微镜和Western blot对其进行鉴定。结果: 经RTPCR扩增出945 bp基因片段， 经测序分析并与GenBank的DNA序列比对分析后， 在NIH3T3细胞中表达。G418筛选后， 细胞荧光信号较强， Western blot检测， 细胞中的融合蛋白能够与抗MAGEA9的多抗结合。结论: 成功地扩增了肝细胞肝癌中的MAGEA9基因全长cDNA并进行真核表达与鉴定。

【关键词】 MAGE A9 真核表达 稳定细胞系

　　肿瘤细胞膜蛋白在肿瘤的发生、 发展和浸润等方面发挥着重要作用， 特别是过表达的蛋白分子。自50年代以来， 科研工作者陆续在黑色素瘤为主的多种肿瘤中发现一些肿瘤相关抗原， 从而成为肿瘤免疫治疗快速发展的基础[1]。黑色素瘤抗原基因（melanoma antigenencoding gene， MAGE）是首先从黑色素瘤中发现的一组肿瘤相关抗原， 其中MAGEA1基因编码的MZ2E抗原是人类肿瘤中分离到的第1个肿瘤抗原。迄今发现MAGE基因家族的已知成员有25个， 各成员间的同源性达80%～99%[2]。本研究中以原发性肝癌临床标本提取mRNA为模板， 真核表达了全长MAGEA9蛋白。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 肝细胞肝癌组织由江苏省苏北人民医院肝脏外科提供。TRIzol、 RTPCR试剂盒购自美国Invitrogen公司。胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒购自Qiagen公司。G418和FuGENE 6购自Roche公司。小牛血清购自杭州四季清生物工程材料研究所。DMEM培养基购自Gibico公司。羊抗人MAGEA9多克隆抗体和鼠抗羊IgG抗体购自Santa cruz公司。ExTaq DNA聚合酶、 T4 DNA连接酶、 pDM18T simple vector购自大连宝生物工程公司。限制性内切酶EcoR I、 Hind III为NEB公司产品。大肠杆菌TG1、 pEGFPC3和NIH3T3细胞为本实验室保存。DNA序列分析由赛百盛公司完成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 引物的设计与合成 根据GenBank中MAGEA9基因序列设计引物片段， P1: 5′GCAAGCTTCGGACTCCCTCTTCCTCCTCTCT3′; P2: 5′GCGGAATTCGAATGTCTCTTGAGCAGAGGAGT3′， 分别引入Hind III和EcoR I酶切位点， 由北京赛百盛公司合成。

　　1.2.2 肝癌组织中总RNA的提取及MAGEA9基因的扩增 取1例经病理证实为肝细胞肝癌的手术切除标本50 mg， 剪碎后加入1 mL TRIzol试剂， 匀浆后移到1.5 mL Eppendorf管中， 静置10 min后加入200 μL氯仿混匀， 静置5 min， 12000 r/min， 4℃离心15 min， 取上清加入等体积的异丙醇沉淀RNA， DEPC处理水溶解沉淀。取5 μL上述RNA溶液， RTPCR扩增 MAGEA9基因。

　　1.2.3 MAGEA9基因的测序与序列分析 PCR产物琼脂糖凝胶电泳回收、 DNA胶纯化试剂盒纯化后， 与pDM18T simple vector连接， 经蓝白斑筛选， 阳性克隆经PCR鉴定后， 由北京三博远志生物工程公司测定DNA序列。
　　
　　1.2.4 MAGEA9基因的真核表达载体的构建 选取经DNA序列测定和Blast比对分析正确的阳性克隆DNA， 按照文献报道的方式[3]， 用限制性内切酶EcoR I、 Hind III消化处理并经琼脂糖凝胶电泳、 DNA胶纯化试剂盒纯化目的基因片段， 与经相同酶切处理、 纯化的表达载体pEGFPC3相连接， 转化感受态大肠杆菌TG1， 扩增阳性克隆并保存。

　　1.2.5 MAGEA9的转染NIH3T3细胞 在6孔板中每孔加入2 mL NIH3T3细胞悬液， 含0.8×105个细胞/孔。24 h后分别加入2种混合液。混合液构成: pEGFPC3A9、 pEGFPC3质粒各4 μg， 与6 μL FuGENE 6预先混合于DMEM， 使混合液总体积达到100 μL。48 h后加入G418筛选， 浓度为500 mg/L。1周后筛选浓度改为100 mg/L。对转染有包含绿色荧光蛋白的载体， 用荧光显微镜观察转染效果。细胞培养于含100 mL/L小牛血清、 100 mg/L青霉素和1000 U/L链霉素的DMEM培养液中， 在37℃， 含50 mL/L CO2湿度饱和的培养箱中培养。

　　1.2.6 MAGE9的Western blot检测 取对数生长期细胞分别转染载体pEGFPC3A9、 pEGFPC3。在含10 mL/L小牛血清的培养基中培养24 h， 使细胞同步化后进行处理。用含1 mg/L Leupeptin和0.5 mmol/L PMSF的预冷PBS洗涤细胞， 用细胞刮器将细胞从培养板中刮落， 加入三去污细胞裂解液（50 mmol/L TriCl pH8.0， 150 mmol/L NaCl， 1 g/L Triton X100， 100 mg/L PMSF， 1 mg/L Aprotinin）置冰上30 min。超声裂解处理3次， 每次10 s; 15000 r/min， 4℃离心30 min， 收集上清， 测其蛋白质浓度， -70℃冻存。取各样品50 μg经100 g/L SDSPAGE凝胶电泳， 再将其转移至硝酸纤维素膜上， 室温下用含50 g/L脱脂奶粉的PBS封闭1 h， 然后与羊抗人MAGEA9多克隆抗体4℃孵育过夜， PBS液洗3次， 每次10 min， 加入HRP标记的鼠抗羊IgG抗体， ECL检测。

　　2 结果

　　2.1 RTPCR扩增MAGEA9基因 临床新鲜肝癌标本经细胞匀浆， 离心取上清与TRIzol混合， 按试剂盒说明提取mRNA， 以MAGEA9基因序列为参考合成的上、 下游序列设计合成的引物， 经RTPCR扩增后纯化MAGEA9基因片段， 目的片段大小为945 bp（图1）。

　　图1 MAGEA9基因RTPCR实验结果（略）

　　1: MAGEA9 DNA; M: DNA marker.

　　2.2 MAGEA9基因的DNA 序列分析 经测序和Blast比对分析后， 序列正确的MAGEA9基因， 经酶切、 纯化后克隆于载体pEGFPC3中， 经PCR扩增和酶切鉴定后， 制备阳性重组载体pEGFPC3A9， 用于NIH3T3细胞的转染。

　　2.3 MAGEA9基因在重组载体pEGFPC3A9转染NIH3T3细胞中的表达 pEGFPC3A9转染NIH3T3后细胞后经荧光显微镜观察， 结果显示G418筛选前， 部分细胞显示转染成功， 有绿色荧光蛋白生成; 经G418筛选后， 所有细胞均有绿色荧光蛋白生成（图2）， 表明真核表达载体转染的细胞系建成。

　　图2 MAGEA9基因在NIH3T3细胞中的表达（×100）（略）

　　A: 荧光显微镜观察pEGFPC3A9转染NIH3T3细胞中融合蛋白的表达; B: 荧光显微镜观察4’，6二脒基2苯吲哚盐酸（DAPI）pEGFPC3A9转染NIH3T3细胞中的细胞核; C: A和B图的叠加图.

　　2.4 MAGEA9基因的表达的Western blot检测 常规制备100 g/L的分离胶和50 g/L的积层胶， SDSPAGE电泳， 考马斯亮蓝染色。将经定量分析后的细胞裂解液与SDSPAGE上样缓冲液混匀处理后， 电泳、 转膜、 抗体结合并检测。重组载体组与空载体相比， 阳性转染细胞可见阳性蛋白条带， 而未转染细胞未见相应条带（图3）。

　　图3 Western blot检测转染细胞的MAGEA9表达（略）

　　1: MAGEA9在pEGFPC3A9稳定转染的细胞中的表达; 2: MAGEA9在转染pEGFPC3的细胞中的表达; 3: MAGEA9在正常细胞中的表达.

　　3 讨论
　　
　　肝细胞癌在我国发病率高， 临床疗效及预后均很不理想， 近来针对肝细胞癌的肝癌发生相关基因的研究成为热点。MAGE这类抗原在正常组织中除睾丸和胎盘组织外均不表达， 但在某些原发性肿瘤和癌细胞中， 如MAGEA1、 MAGEA2、 MAGEA3、 MAGEA4、 MAGEA6、 MAGEA10和 MAGEA12等高度特异性表达[2， 4]， 同时它们经MHC1类分子提呈到细胞表面后， 可为自体细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte， CTL)识别[5， 6]， 因而是CTL一种介导的特异性免疫治疗的理想靶分子。MAGEA9 cDNA全长945 bp， 编码Mr 35000的蛋白产物。本实验中通过在真核细胞中克隆并表达MAGEA9基因。
　　
　　MAGE基因最初发现于恶性黑色素瘤， 后陆续发现在多种恶性肿瘤中都有表达[7]。Chomez等[8]发现， 人皮肤伤口愈合过程第1～7天的新生组织中， MAGE基因有一过性表达， 因此推测MAGE家族不仅仅和肿瘤有关， 和组织细胞的正常生长和分化也相关。迄今为止的研究表明， MAGEA9的表达范围与MAGEA家族的其他成员相比要小， 在食道腺癌、 膀胱癌等组织中发现表达[2， 9]。由于MAGEA9可以被一些化疗药物诱导表达[9]， 提示， MAGEA9有可能作为免疫治疗或化疗结合免疫治疗的一个新的靶点。因此， 对MAGEA9基因转化细胞系的建立， 明确其在细胞中表达及定位， 这不但有助于对MAGEA9基因功能的研究， 对MAGEA9基因过表达肿瘤的免疫治疗也具有重要意义。
　　
　　本研究中利用RTPCR方法， 从人肝癌组织中克隆出目的基因全长片段， 经测序确认为MAGEA9基因， 构建了真核表达载体pEGFPMAGEA9， 通过G418筛选， 建立稳定表达的细胞系。经荧光检测， 细胞能够稳定表达绿色荧光蛋白。为了研究目的蛋白是否在转染的细胞系中表达， 经抗MAGEA9抗体的Western blot分析， 表明MAGEA9能够在该细胞系中稳定表达。该研究为进一步研究MAGEA9细胞定位、 功能以及与肿瘤发生的关系奠定了实验基础。

参考文献

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　　[2] Lin J， Lin L， Thomas DG， et al. Melanomaassociated antigens in esophageal adenocarcinoma: identification of novel MAGEA10 splice variants[J]. Clin Cancer Res， 2004， 10(17): 5708-5716.

　　[3] 徐军发， 袁春雷， 杨 衡， 等. 小鼠B7H4基因克隆及真核表达载体的构建[J]. 细胞与分子免疫学杂志， 2007， 23(7): 665-667.

　　[4] Chomez P， Backer OD， Bertrand M， et al. An overview of the MAGE gene family with the identification of all human members of the family[J]. Cancer Res， 2001， 61(14): 5544-5551.

　　[5] Eichmuller S， Usener D， Thiel D， et al. Tumorspecific antigens in cutaneous Tcell lymphoma: expression and seroreactivity[J]. Int J Cancer， 2003， 104(4): 482-487.

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　　[8] Chomez P， Backer OD， Bertrand M， et al. An overview of the MAGE gene family with the identification of all human members of the family[J]. Cancer Res， 2001， 61(14): 5544-5551.

　　[9] Picard V， Bergeron A， Larue H， et al. MAGEA9 mRNA and protein expression in bladder cancer[J]. Int J Cancer， 2007， 120(10): 2170-2177.