改造稀有密码子对rhFGF8a原核表达的影响

　　　　 作者：黄明， 蒋寅， 周飞燕， 付灿， 雷文瑾

【摘要】 　　目的: 构建重组人成纤维细胞生长因子8a（rhFGF8a）高效表达载体， 提高该蛋白的表达量。方法: 采用PCR技术设计引物替换rhFGF8a基因N端的稀有密码子以及稀有终止子， 构建原核表达载体pET22bmrhFGF8a， 转化大肠杆菌， 用异丙基β硫代半乳糖（IPTG）诱导表达， Sephacryl S200纯化表达蛋白， MTT法检测其生物学活性。结果: 表达产物经SDSPAGE、 Western blot鉴定， 目的蛋白量占全菌蛋白的31%， Sephacryl S200纯化后蛋白纯度可达97.28%， 且具促进NIH3T3细胞增殖活性。结论: 通过改造稀有密码子的方法有效地提高了真核基因在原核表达体系中的表达量。

【关键词】 FGF8a 稀有密码子 基因表达

　　成纤维生长因子（fibroblast growth factor， FGF）是一类通过与细胞膜特异性受体结合发挥作用， 在胚胎发育期调节细胞生长、 迁移和分化， 在成体中具有创伤反应、 组织修复功能的肽类分子[1]。FGF8是FGF家族的第8个成员， 是神经干细胞培养和诱导多巴胺能神经元的重要营养因子[2]。自体神经干细胞体外培养、 诱导多巴胺能神经元、 进行细胞移植已成为治疗帕金森病之类的多巴胺能神经元功能障碍疾病的新趋势， 而应用于其中的FGF8a目前都是通过常规的生化方法从动物组织中提取， 来源少， 成本高。本研究中， 我们通过基因工程技术构建的工程菌， 高效表达rhFGF8a， 为深入研究FGF8a及其产业化打下坚实基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 rhFGF8a的原核表达载体pET28a(+)rhFGF8a由新西兰皇家科学院林俊生博士惠赠。原核表达载体pET22b(+)由华南农业大学廖晓萍博士惠赠。大肠杆菌Rosetta（DE3）、 BL21（DE3）pLysS由本实验室保存。NIH3T3细胞购自中山大学实验动物中心 。限制性内切酶Nde I和EcoR I、 T4 DNA连接酶、 Premix Taq酶购自大连宝生物公司。其他试剂均是进口或国产的分析纯试剂。FGF8单克隆抗体（mAb）购自Novagen。引物合成、 DNA测序由大连宝生物公司完成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 mrhFGF8a原核表达载体构建 设计引物: 上游引物含Nde I位点并将稀有密码子AGG突变为CGT; 下游引物含有EcoR I位点并将稀有密码子TAG突变为TAA。上游引物: 5′GGAATTCCATATGCATGTGCGTGAGCAGAGCCTGGTGACG3′; 下游引物5′TACGAATTC TTATCGGGGCTCCGGGGCC3′。以pET28a(+)rhFGF8a为模板， PCR扩增获得mrhFGF8a片段。用限制性内切酶Nde I和EcoR I分别对回收的PCR产物、 表达载体pET22b(+)双酶切。酶切的载体与PCR产物用T4 DNA连接酶连接。连接产物转化大肠杆菌Rosetta（DE3）及BL21（DE3）pLysS， 将转化了pET22b(+)mrhFGF8a的菌株涂布于含有50 mg/L氨苄青霉素的LB琼脂平板。挑取阳性克隆， 置含相应抗生素的LB培养液的试管中37℃振摇过夜， 用碱裂解法小量制备质粒DNA， 获取的质粒分别用Nde I和EcoR I单、 双酶切， 10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定， 同时将质粒进行DNA测序鉴定。

　　1.2.2 目的蛋白的诱导表达及鉴定 将过夜活化菌株接种至含相应抗生素的2×YT培养基中， 于37℃恒温振荡培养约3 h， 至A600达到约0.6， 加入IPTG诱导培养5 h后， 离心收集菌体， SDSPAGE电泳鉴定。用FGF8的mAb对pET22b(+)mrhFGF8a及原pET28a(+)rhFGF8a表达产物进行Western blot鉴定。

　　1.2.3 表达产物的纯化 冰浴超声波破碎菌体， 7000 r/min离心15 min， 收集包涵体。以20 mL包涵体变性缓冲液收集溶解包涵体， 离心， 取上清。采用SephadexG25凝胶层析进行柱上复性; 蛋白核酸分析仪检测， 收集复性rhFGF8a多肽， 聚乙二醇6000包埋浓缩。用Sephacryl S200层析柱初步分离纯化复性的包涵体， 用分子筛柱层析缓冲液进行洗脱， 以蛋白核酸分析仪检测， 收集280 nm紫外光吸收峰所对应的洗脱物。SDSPAGE电泳鉴定。

　　1.2.4 rhFGF8a的促细胞生长活性的鉴定 根据《中国药典》2005年版所述方法， 将NIH3T3细胞铺板培养至对数生长期时， 用含100 mL/L小牛血清的DMEM培养基稀释已过滤除菌的rhFGF8a纯品， 终浓度分别为500 μg/L、 1000 μg/L、 1500μg/L、 2000 μg/L、 2500μg/L、 3000μg/L、 3500μg/L、 4000 μg/L、 4500 μg/L， 用含100 mL/L小牛血清的DMEM培养基作空白对照， 以630 nm为参比波长， 于波长570 nm 处测定吸光度。

　　2 结果

　　2.1 pET22b(+)mrhFGF8a重组质粒的构建 采用PCR技术将原pET28a(+)rhFGF8a中的精氨酸稀有密码子及稀有终止子同义替换， 酶切后与pET22b(+)连接， 并转化大肠杆菌Rosetta（DE3）和BL21（DE3）pLysS， 挑取单菌落， 小量提取质粒。经Nde I、 EcoR I单、 双酶切鉴定及DNA测序鉴定结果均证实pET22b(+)mrhFGF8a构建正确。

　　2.2 rhFGF8在原核系统中的高效表达及鉴定 质粒pET22b(+)mrhFGF8a转化至大肠杆菌Rosetta（DE3）、 BL21（DE3）pLysS后， 经IPTG诱导表达， 在pET22b(+)mrhFGF8aBL21、 pET22b(+)mrhFGF8aRosetta表达体系中目的蛋白的表达量明显提高(图1)。经Western blot鉴定， 原pET28a(+)rhFGF8a和pET22b(+)mrhFGF8a在大肠杆菌中均正常表达， 且pET22b(+)mrhFGF8a体系的表达量比原pET28a(+)rhFGF8a体系明显要高(图2)。

　　图1 不同表达体系中表达产物的SDSPAGE电泳分析（略）

　　M: 蛋白maker; 1: pET28a(+)rhFGF8aBL21诱导后; 2: BL21空白菌诱导后; 3: pET22b(+)mrhFGF8aBL21诱导后; 4: Rosetta空白菌诱导后; 5: pET22b(+)mrhFGF8aRosetta诱导后.

　　图2 rhFGF8a的Western blot分析（略）

　　1: pET28a(+)rhFGF8a蛋白; 2: pET22b(+)mrhFGF8a蛋白.

　　2.3 目的蛋白的纯化 采用SephadexG25凝胶层析进行柱上复性， 并用Sephacryl S200层析柱初步分离纯化复性的包涵体。全菌蛋白中， 目的蛋白含量为31%， 其中大部分以包涵体的形式存在， 包涵体的纯度达到80.74%。经G25复性、 Sephacryl S200层析柱进一步纯化后， rhFGF8a的纯度为97.28%(图3)。初步纯化后的rhFGF8a， 其纯度达到用于进一步的生物学活性实验的要求。

　　2.4 rhFGF8a的促细胞生长活性的鉴定 采用MTT（噻唑蓝）法检测传代细胞NIH3T3的活细胞数量。加入不同浓度的、 并已纯化的rhFGF8a对细胞生长影响的结果（图4）。rhFGF8a在500 μg/L～4000 μg/L这个浓度范围内， 对NIH3T3细胞生长有促进作用; 浓度超过4000 μg/L则会抑制细胞的生长。而阴性对照则对NIH3T3细胞生长无促进作用。

　　图3 经Sephacryl S200纯化后的rhFGF8a的SDSPAGE分析（略）

　　M: 蛋白maker; 1: IPTG诱导前; 2: IPTG诱导后; 3: 包涵体; 4: 纯化后的rhFGF8a蛋白.

　　图4 rhFGF8a浓度与细胞生长代谢的关系曲线（略）

　　3 讨论
　　
　　本实验通过设计PCR引物将原rhFGF8a基因片段N端的稀有密码子AGG替换为大肠杆菌偏好密码子CGT， 使得rhFGF8a的表达量明显提高。尤其是在不含有稀有密码子tRNA的宿主菌BL21中， 为提高目的蛋白的产量而对目的基因中的稀有密码子进行同义替换是很有必要的。
　　
　　人体内FGF8有a、 b、 e、 f 4个亚型， 一般情况下FGF8b为优势表达亚型。但是， 在癌细胞中FGF8b的表达量大大高于FGF8a， 其信号强度也比FGF8a大[3]。FGF8a在人体内的生物学活性与FGF8b有一定差别[4]。在前列腺癌细胞生长抑制剂的作用下癌细胞的生长之被抑制， FGF8b表达减少， 而FGF8a的表达量却显著增大[5]。另外， FGF8a促进细胞间隙连接蛋白Cx43基因的表达， 抑制细胞恶变、 阻止肿瘤发生， Cx43基因也因此被誉为“第2代抑癌基因”[6]。因此， FGF8a具有FGF8的生物学特性， 同时其可能的致癌性较小， 适合作为药物进行开发。
　　
　　我们在本实验中获得了具有生物学活性的rhFGF8a， 但纯化过程中蛋白得率较低， 下一步将对表达和纯化工艺进行深入研究， 为使之尽快成为基因工程药物并实现产业化打下基础。

参考文献

　　[1] Ornitz DM， Itoh N. Fibroblast growth factors[J]. Genome Biol， 2001， 2(3): 1-12.

　　[2] Wagenr J， Akerud P， Castro DS， et al. Induction of a midbrain dopaminergic phenotype in Nurr1overexpressiong neural stem cells by type I astrocytes[J]. Nat Biotechnol， 1999， 17(7): 653-659.

　　[3] Sato T， Nakamura H. The Fgf8 signal causes cerebellar differentiation by activating the RasERK signaling pathway[J]. Development， 2004， 131(17): 4275-4285.

　　[4] Liu A， Li JY， Bromleigh C， et al. FGF17b and FGF18 have different midbrain regulatory properties from FGF8b or activated FGF receptors[J]. Development， 2003， 130(25): 6175-6185.

　　[5] Brondani V， Hamy F. Retinoic acid switches differential expression of FGF8 isoforms in LNCaP cells[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2000， 272(1): 98-103.

　　[6] Rose B， Mehta PP， Loewenstein WR. Gap junctional protein gene suppresses tumorigenicity[J]. Carcinogenesis， 1993， 14(5): 1073-1075.