连翘提取物对小鼠腹腔巨噬细胞体外吞噬和NO释放的影响

　　　　　　 作者：尹乐乐， 曾耀英， 侯会娜

【摘要】 　　目的: 分析连翘(FS )对小鼠腹腔巨噬细胞的体外吞噬和体外NO释放的影响。方法: 无菌收集小鼠腹腔巨噬细胞和羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFDASE)标记大肠杆菌DH5α， 短期培养3 h后流式细胞术(FCM)分析FS对腹腔巨噬细胞体外吞噬的影响。用LPS体外刺激活化腹腔巨噬细胞， Griess Reagent试剂盒检测并分析FS对巨噬细胞体外释放NO的影响。结果: FCM分析显示， 终浓度为40、 80、 160 mg/L的FS对小鼠腹腔巨噬细胞体外吞噬具有明显的促进作用(P&<0.05)。不同终质量浓度的FS对LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞体外NO的释放均有抑制作用(P&<0.05)。结论: FS可以促进小鼠腹腔巨噬细胞的体外吞噬和抑制NO体外的释放。

【关键词】 连翘提取物 腹腔巨噬细胞 吞噬 NO释放

　　［Abstract］ AIM: To investigate the effect of forsythia suspensa (FS) extract on phagocytosis of peritoneal macrophages and NO production in vitro. METHODS: The peritoneal macrophagess were isolated from BALB/c mice. After stained with CFDASE， the DH5α were cocultured with peritoneal macrophagess for 3 h. The effect of FS extract on cytophagocytesis in vitro was analyzed by flow cytometry. The peritoneal macrophages were stimulated and activated by LPS in vitro. The effect of FS extract on NO production of the peritoneal macrophages in vitro was measured by NO assay kit. RESULTS: FCM analysis showed that FS extract significantly promoted the phagocytosis of peritoneal macrophages at the final concentration of 40， 80， 160 mg/L， respectively (P&<0.05). It also decreased the production of NO at different concentration induced by LPS (P&<0.05). CONCLUSION: FS extract can promote phagocytosis of peritoneal macrophages and inhibit NO production in vitro.

　　［Keywords］forsythia suspensa extract;peritoneal macrophages;phagocytosis; NO production

　　连翘(forsythia suspensa， FS)又名旱莲子、 大翘子、 落翘等， 为木犀科植物连翘的果实。它作为传统中药广泛应用于对炎症、　　发热和溃疡等方面的治疗［1］。同时， FS的主要活性成分连翘苷在抗氧化、 抗菌、 抗病毒和解热抗炎等方面［2］也起着重要的作用。本研究我们通过检测FS对小鼠腹腔内巨噬细胞体外吞噬和NO释放的影响， 进一步研究其免疫学效应。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 清洁级BALB/c近交系小鼠(雄性， 8～10周龄， 体质量20～22 g)购自广东省实验动物中心。FS购自四川广汗市维康植化有限公司。L谷氨酰胺、 β巯基乙醇、 刀豆蛋白A(concanavalin A， ConA)购自Sigma公司。羧基荧光素乙酰乙酸(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester， CFDASE)购自美国Molecular Probes 公司。RPMI1640、 胎牛血清(fetal bovine serum， FBS)为美国GibcoBRL公司产品。Griess Reagent试剂盒为美国Promega公司产品。流式细胞仪(FACSCalibur)为美国Becton Dickinson公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 小鼠腹腔巨噬细胞的制备和细胞培养 断颈处死小鼠， 用750 mL/L乙醇消毒， 腹腔注射RPMI1640完全培养液约5 mL。用棉球轻揉腹壁1～2 min后， 收集腹腔液， 1500 r/min离心10 min， 弃上清， 用RPMI1640完全培养液(含100 mL/L的FBS)调整细胞密度为2×109/L。根据需要接种于24孔(1mL/孔) 或96孔(0.2mL/孔)细胞培养板中， 37℃、 50mL/L CO2培养箱培养3 h 。轻轻吸弃培养液后， 再用RPMI1640完全培养液洗去未贴壁细胞， 继续培养［3］。

　　1.2.2 对大肠杆菌DH5α的染色标记 采用CFDASE染色标记大肠杆菌DH5α。CFDASE用二甲基亚砜(DMSO)溶解成10 mmol/L的储存液， -20℃ 保存。临用前， 取适量用PBS稀释成1 mmol/L的工作液， 备用。新鲜大肠杆菌DH5α离心弃去LB培养基(4 000 g， 6 min)， 冷PBS洗涤1次， 调整细菌密度为1×1010/L， 加入CFDASE工作液(终浓度为8 μmol/L)， 充分混匀后在37℃摇床振荡(220 r/min， 15 min)。RPMI1640培养基静置10 min终止染色后离心， 经RPMI1640洗涤2次(4000 g， 6 min)后， 重悬。流式细胞术(FCM)检测DH5α的CFDASE染色标记率为90%。

　　1.2.3 巨噬细胞体外吞噬 将CFDASE标记好的大肠杆菌DH5α(1×107/孔)与小鼠腹腔巨噬细胞(细胞密度为2×109/L)一同接种到24孔板内。实验分组及处理: 设2组空白对照(RPMI1640完全培养液组和PBS组)和不同终质量浓度FS组: (RPMI1640+FS 40)、 (RPMI1640+FS 80)、 (RPMI1640+FS 160)、 (PBS+FS 40)、 (PBS+FS 80)、 (PBS+FS 160)接种于24孔培养板。每组各设6个重复孔。37℃、 50 mL/L CO2培养箱中温育3 h后， 用细胞刮轻轻刮下贴壁的巨噬细胞， 各组分别经由70 μm滤器过滤， 立即以FCM检测。

　　1.2.4 巨噬细胞体外NO释放 实验分组及处理， 设阴性对照组(单独RPMI1640完全培养液组)、 阳性对照组(单独LPS组)、 不同终质量浓度的单纯FS组和(FS+LPS)组， 每组设6个复孔， 接种于96孔培养板。给药组细胞与药物FS共孵育4 h后， 再加入LPS(终浓度为10 mg/L)刺激继续培养24 h。收集相应培养上清-20℃保存。采用Griess Reagent试剂盒(Promega)以检测小鼠巨噬细胞培养上清中的NO稳定氧化代谢产物亚硝酸盐(NO-2)水平， 间接反映NO的释放量。50 mL小鼠巨噬细胞培养上清加入96孔平底酶标板中， 按试剂盒操作说明加入试剂， 室温避光孵育10 min， 检测A540值。

　　1.2.5 FCM检测及分析 所有样品经FACSCalibur流式细胞仪和CELLQuest软件获取。先在前散射(FSC)对侧散射(SSC)二维散点图中， 划出巨噬细胞细胞区R1。CFDASE为荧光1(FL1)。M1表示腹腔巨噬细胞吞噬经CFDASE标记后DH5α百分率。全部数据经FACSCalibur流式细胞仪和CellQuest软件获取， 每管样品检测10000个细胞， 获得的数据用CellQuest软件分析。统计学分析用统计软件包SPSS10.0进行处理， 数据以x±s表示， 多组间比较采用方差分析， 两两间比较用LSDt检验。

　　2 结果

　　2.1 FS对腹腔巨噬细胞体外吞噬的影响 表1结果显示， 仅对照组RPMI1640完全培养液和PBS组之间比较， 发现RPMI1640 悬浮的巨噬细胞吞噬率比对照组PBS表现较高。对照组RPMI1640 完全培养液和(RPMI1640+FS)组比较， 各浓度FS组均可促进巨噬细胞吞噬率的增加， 具有统计学意义。对照组PBS和(PBS+FS)组比较， 相同浓度FS组也可促进巨噬细胞吞噬率的增加， 具有统计学意义。不同浓度FS间比较有一定的浓度梯度依赖性。巨噬细胞体外吞噬的一次代表性实验结果(图1)。

　　表1 FS对腹腔巨噬细胞体外吞噬影响（略）

　　Tab 1 Influence of FS on the phagocytosis of peritoneal macrophage in vitro

　　aP&<0.05 vs RPMI1640 cocultured group; cP&<0.05 vs PBS cocultured group; FS: Forsythia suspensa extract.

　　图1 腹腔巨噬细胞体外吞噬DH5α（略）

　　Fig 1 Phagocytosis of peritoneal macrophage on DH5α in vitro

　　2.2 FS对腹腔巨噬细胞体外NO释放的影响 表2结果显示， 单纯RPMI1640完全培养液组为阴性对照组。不同终质量浓度的单纯FS组均可抑制巨噬细胞体外NO释放， 且随着药物浓度的升高其抑制NO释放的程度越高， 具有统计学意义。LPS组为阳性对照组， 它的NO释放结果为(0.36±0.01) μmol/L。在(LPS+FS)组中， FS也可抑制LPS诱导刺激巨噬细胞体外NO释放， 不同浓度间也随着药物浓度的升高其抑制NO释放的程度越高， 具有统计学意义。与单纯FS组作用趋势呈一致性。巨噬细胞体外吞噬的统计学实验结果见图2。

　　图2 FS对腹腔巨噬细胞体外NO释放影响（略）

　　Fig 2 Influence of FS on NO production of peritoneal macrophage in vitro

　　aP&<0.05 vs control group; cP&<0.05 vs LPS stimulation group; FS40， FS80， FS160: FS concentration of 40， 80， 160 mg/L， respectively.

　　表2 FS对腹腔巨噬细胞体外NO释放影响（略）

　　Tab 2 Influence of FS on NO production of peritoneal macrophage in vitro

　　aP&<0.05 vs control; cP&<0.05 vs LPS stimulation group; FS: Forsythia suspensa extract.

　　3 讨论
　　
　　腹腔中的巨噬细胞主要是通过引起和调节局部细胞介导的免疫反应来调节和维持腹腔环境的稳定， 是一种十分重要的免疫辅助细胞。它在细胞膜上表达MHCI/II类分子和多种黏附分子以及IgG Fc受体(FcγR)、 C3b受体(CRI)和多种细胞因子受体。在与多种病原微生物识别与结合过程中， 可以高表达IA抗原和分泌较高水平L10， 通过受体与病原体等抗原异物结合经吞噬或吞饮作用， 主动吞噬、 杀伤和消化病原微生物等抗原性物质。
　　
　　本实验我们采用新的方法， 用CFDASE标记DH5α在体外被小鼠腹腔巨噬细胞吞噬， 间接证实了FS可促进小鼠腹腔巨噬细胞的体外吞噬。不同浓度的FS对其吞噬影响呈一定的梯度表现， 与对照相比均有统计学意义。我们推测FS可能通过与腹腔巨噬细胞表面的受体间的特异性结合而促进了巨噬细胞的吞噬功能; 或者也可能对作为抗原的大肠杆菌DH5α的受体Fc段存在一定的调理作用， 从而协同促进了腹腔巨噬细胞识别、 结合并吞噬的过程。
　　
　　腹腔巨噬细胞的NO释放是由LPS协同INFγ、 TNFα等细胞因子作用刺激诱导诱导型一氧化氮合酶(iNOS)所达成的［4］。我们已知NO作为体内重要的生物活性物质， 可以兼具细胞间、 细胞内信使以及神经递质作用的信号分子。它是由血管及机体许多其他组织类型的细胞合成， 以自分泌或旁分泌作用参与正常生理过程和某些疾病的发生发展， 如血管扩张、 血管通透性、 血小板黏附和聚集、 神经信号转导、 宿主防御反应等等。此外， 在免疫学上NO也具有重要的意义。它作为机体非特异性免疫系统的组成部分之一， 起着免疫效应分子和免疫调节剂的作用， 可以杀伤细菌、 病毒和肿瘤细胞。但是， NO过量可对宿主细胞产生细胞毒性作用， 损害宿主细胞活性和导致基因突变， 如NO过量可诱发肿瘤， 有研究发现肿瘤的发生和发展与血液NO的浓度可呈正相关［5］。此外， 临床上NO过量还常表现在的休克和哮喘等［6］。
　　
　　已知LPS诱导激活巨噬细胞一般是沿2条道路进行启动信号转导途径: 一是LPS与靶细胞膜相应受体作用并启动胞内信号转导途径; 二是LPS作用细胞后， 核内基因表达的变化及其上游信号分子的确定［6］。研究表明LPS的刺激可激活或增强通路MAPK家族(ERK1/2， JNK1/2以及p38MAPK)的磷酸化， 同时还可促进巨噬细胞分泌释放PGE2使之与其细胞表面G蛋白偶联的受体结合激活腺苷酸环化酶， 导致cAMP 释放增加及PKA的活化［7］。本试验结果表明FS对LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞体外NO释放有抑制作用。低浓度FS(40 mg/L)即可抑制腹腔巨噬细胞NO的体外释放， 且各浓度梯度FS与对照组比较均有统计学意义。由此我们推测FS抑制小鼠腹腔巨噬细胞体外释放NO的原因在于FS可能参与和影响了LPS诱导的某些通路的表达。文献表明FS可以抑制cAMP磷酸二酯酶的活性并在一定程度上能够降低胞内cAMP的含量［8］; 它还可以抑制p38MAPK的活化、 阻断NFκB途径作用以及抑制iNOS蛋白和mRNA的表达［9］， 这些均为FS抑制腹腔巨噬细胞体外释放NO提供了理论依据。

参考文献

　　［1］ Li HB， Chen F. Preparative isolation and purification of phillyrin from the medicinal plant Forsythia suspensa by highspeed countercurrent chromatography ［J］. Chromatogram A， 2005， 1083(1-2): 102-105.

　　［2］ Schinella GR， Tournier HA， Prieto JM， et al. Antioxidant activity of antiinflammatory plant extracts［J］. Life Science， 2002， 70(9): 1023-1033.

　　［3］ 李杰萍， 梁 统， 周志元. 5脂氧合酶及其激活蛋白在大鼠腹腔巨噬细胞中的表达［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2003， 19(6): 606-607.

　　［4］ Marletta MA. Nitric oxide synthase structure and mechanism［J］. J Biol Chem， 1993， 2(68): 12231-12234.

　　［5］ 范文韜， 刘德立. 一氧化氮代谢与细胞色素P450［J］. 生物化学与生物物理学报， 2000， 7(2): 75-77.

　　［6］ 金惠铭， 卢 建， 殷莲华. 细胞分子病理生理学 ［M］. 郑州: 郑州大学出版社， 2002: 225-235.

　　［7］ 林明群， 张宗梁. 巨噬细胞免疫调变信号——PKA与PKC对MAPK信号通路的调节［J］. 生物化学与生物物理学报， 1999， 31(6): 701-706.

　　［8］ 南京中医药大学. 中药大辞典(上册)［M］. 上海: 上海科学技术出版社， 2006: 1552-1555.

　　［9］ Jin HK， Dong HK， Seung HB， et al. Rengyolone inhibits inducible nitric oxide synthase expression and nitric oxide production by downregulation of NFκB and p38 MAP kinase activity in LPSstimulated RAW 264.7 cells［J］. Biochem Pharmacol， 2006， 71(8): 1198-1205.