罗格列酮对高糖诱导的人肾小管上皮细胞血小板反应蛋白1和BMP7表达的影响

　　　　 作者：丁新国， 李英*， 李晓东， 张红梅

【摘要】 　　目的: 探讨罗格列酮(RSG)对高糖环境下人肾小管上皮细胞（HK2）血小板反应蛋白1（TSP1）和骨形成蛋白7（BMP7）mRNA和蛋白表达的影响。方法: 将体外培养的人肾小管上皮细胞分为正常糖对照组（NG）、 高糖组（HG）、 渗透浓度对照组（MG）、 分别含RSG 5、 10、 20 μmol/L的高糖DMEM培养基培养的RSG干预组（R5、 R10、 R20）， 并于培养48 h后终止培养。免疫细胞化学方法检测人肾小管上皮细胞TSP1、 BMP7、 结缔组织生长因子（CTGF）蛋白的表达， RTPCR法检测人肾小管上皮细胞中TSP1、 BMP7、 CTGF mRNA表达。结果: 高糖环境下， HK2细胞TSP1、 CTGF mRNA和蛋白表达明显升高（P&<0.05）， BMP7 mRNA和蛋白表达明显降低（P&<0.05）， 加入RSG后， HK2细胞TSP1、 CTGF的表达较NG组明显降低（P&<0.05）， BMP7的表达明显升高（P&<0.05）。结论: RSG可以抑制高糖诱导的人肾小管上皮细胞TSP1、 CTGF高表达， 提高BMP7的表达， 具有一定的肾脏保护作用。

【关键词】 血小板反应蛋白 1 骨形成蛋白 7 罗格列酮 高糖 肾小管上皮细胞

　　近年来， 发现肾小管上皮细胞在糖尿病肾病的发生发展中有着不可忽视的作用[1]。研究糖尿病小管间质病变发生、 发展的机制， 以及寻找干预治疗小管间质病变的措施具有重要意义。罗格列酮（rosiglitazone， RSG）属于噻唑烷二酮类药物（thiazolidinediones， TZDs）， 是通过结合并激活核转录因子即过氧化物酶增殖体激活受体γ（peroxiomeproliferator activated receptor γ， PPARγ）， 改善胰岛素敏感性、 降低胰岛素抵抗而发挥作用。近年认为RSG尚有独立于增敏、 降血糖之外的肾脏保护作用。TZDs还具有抗炎、 影响细胞增殖和转分化、 抗脏器纤维化等作用。但TZDs类药物的作用是否与调节血小板反应蛋白1（thrombospondin1， TSP1）、 结缔组织生长因子（connective tissue growth factor， CTGF）、 骨形成蛋白7（bone morphogenetic proteins7， BMP7）的表达的效应相关， 目前国内外研究较少。我们利用体外实验观察RSG对高糖条件下肾小管上皮细胞表达TSP1、 CTGF和 BMP7表达的干预作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 人肾脏近曲小管上皮细胞株（HK2）购自中国协和医科大学细胞中心。TRIzol总RNA提取试剂盒（美国Invitrogen 公司）， 反转录（RT）试剂盒（美国Promega公司）， Taq DNA聚合酶、 PCR引物及寡核苷酸片段（上海生工公司）， DMEM(美国Sigma公司）， 胎牛血清（杭州四季青）。罗格列酮（天津史克必成有限公司）， 小鼠抗大鼠TSP1单克隆抗体（mAb）(ACBCM公司)、 山羊抗大鼠BMP7多克隆抗体（美国Santa Cruz公司）、 山羊抗大鼠CTGF多克隆抗体（美国Santa Cruz公司）。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养及分组 HK2细胞生长于含100 mL/L灭活新生牛血清、 100 KU/L青霉素、 100 mg/L链霉素的正常糖DMEM培养基（D葡萄糖浓度5.5 mmol/L）， 置37℃、 50 mL/L CO2培养箱中培养， 每3～4 d更换培养液1次， 待细胞生长至亚融合状态时更换为无血清DMEM培养基使细胞生长同步化24 h。然后将细胞分为以下各组: ①正常糖对照组（NG组含5.5 mmol/L D葡萄糖）; ②高糖组（HG组含25 mmol/L D葡萄糖）; ③渗透浓度对照组（MG组含19.5 mmol/L甘露醇和5.5 mmol/L D葡萄糖， 终浓度为25 mmol/L）， 以确保实验组之间渗透浓度相同; ④HG＋RSG（5 μmol/L）组; ⑤HG＋RSG（10 μmol/L）组; ⑥HG＋RSG（20 μmol/L）组。作用48 h后取样观察， 每组均含3瓶细胞（n=3）。

　　1.2.2 免疫细胞化学染色 按实验分组条件处理后的细胞爬片， 采用SABCHRPDAB法(试剂盒购自武汉博士德公司)分别检测TSP1、 CTGF、 BMP7的表达。一抗为山羊抗BMP7多克隆抗体(1∶100， Santa Cruz公司)， 山羊抗CTGF多克隆抗体(1∶50， Santa Cruz公司)， 小鼠抗TSP mAb（1∶50稀释， ABCAM公司） 37℃孵育3 h， 滴加 1∶200稀释的生物素化IgG二抗， 37℃孵育1 h; 滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液37℃孵育30 min， DABh3O2显色10 min， 苏木素复染固定。以PBS缓冲液替代一抗作阴性对照。显微镜下观察， 数据分析使用麦克奥迪数码医学图像分析系统， 随机选取10个高倍视野， 测阳性细胞的平均光密度（A）值， 比较各组细胞的平均光密度（A）值。

　　1.2.3 RTPCR法检测各组HK2细胞中TSP1、 BMP7、 CTGFmRNA表达 按TRIzol试剂盒说明书操作。提取总RNA， 用紫外分光光度计测A260/A280值。A260/A280值&>1.8者可用取总RNA 2 μg作逆转录， 按逆转录试剂盒说明操作。取1 μg逆转录产物为模版进行PCR反应。引物由上海生物工程公司合成。人的GAPDH: 206 bp 上游: 5′CGC ACC ACT GGC ATT GTC AT3′; 下游: 5′TTCTCCTTGATGTCACGCAC3′; TSP: 420 bp 上游: 5′TCCAAGGAAAGCAGCACG3′; 下游: 5′AGGAGATGCCGCAGATGG3′; CTGF: 540 bp 上游: 5′GGTGCTCCCTGCATCTTCG3′; 下游: 5′ACAGGCGGCTCTGCTTCTC3′; BMP7: 294 bp上游: 5′CTTCAGCCTGGACAACGAG3′; 下游; 5′GTGAGGAAATGGCTATCTTGC3′。内参GAPDH反应条件为: 94℃预变性4 min， 94℃变性20 s， 55℃复性20 s， 72℃延伸30 s， 进行30个循环， 随后72℃终延伸7 min。BMP7反应条件为: 94℃预变性4 min， 94℃变性20 s， 59.1℃复性20 s， 72℃延伸30 s， 进行35个循环， 随后72℃终延伸 7 min。TSP1反应条件为: 94℃预变性4 min， 94℃变性20 s， 55℃复性20 s， 72℃延伸30 s， 进行30个循环， 随后72℃终延伸7 min。CTGF反应条件为: 94℃预变性4 min， 94℃变性20 s， 55℃复性30 s， 72℃延伸40 s， 进行30个循环， 随后72℃终延伸7 min。重复3次独立的RTPCR全过程。取PCR产物6 μL， 15 g/L琼脂糖凝胶电泳， 约1.5 h。凝胶在凝胶成像系统中扫描结果、 拍照， 分析电泳带吸光度， 计算目的基因与内参GAPDH之比值， 即得目的基因mRNA表达量。

　　1.2.4 统计学处理 所有数据用x±s表示， 利用SPSS10.0软件进行统计学分析， 采用单因素方差分析及SNK检验比较各组间差异。

　　2 结果

　　2.1 各组细胞免疫组化染色结果 阳性染色为HK2细胞胞质棕黄色颗粒， 阴性胞质为淡紫蓝色， 胞核为蓝色。NG组和MG组， TSP1和CTGF均呈阴性; BMP7呈强阳性。HG组， TSP1和CTGF均呈阳性， BMP7呈弱阳性， 与NG组和MG组相比， 平均光密度值ACTGF、 ATSP1均明显增加（P&<0.01）， ABMP7明显降低（P&<0.01）。与NG组和MG组相比， R5、 R10、 R20组平均光密度值ACTGF、 ATSP1均降低（P&<0.05）， ABMP7明显升高（P&<0.05， 表1）。

　　表1 各组肾小管上皮细胞TSP1、 CTGF及BMP7的表达（略）

　　aP&<0.05 vs HG; bP&<0.01 vs NG or MG.

　　2.2 各组细胞TSP1、 CTGF及BMP7mRNA表达情况 NG组及MG组HK2细胞TSP1、 CTGFmRNA有微量表达， BMP7mRNA有较高表达; HG组TSP1、 CTGFmRNA表达较NG组明显升高(P&<0.05)， BMP7mRNA表达下降(P&<0.05); 与HG组相比， R5、 R10、 R20组HK2细胞TSP1、 CTGFmRNA表达下调(P&<0.05)， 但没有恢复到NG组水平; BMP7mRNA表达上调(P&<0.05)， 但没有恢复到NG组水平（表2）。

　　表2 各组肾小管上皮细胞TSP1、 CTGF及BMP7mRNA的相对表达量（略）

　　aP&<0.05 vs HG; bP&<0.01 vs NG or MG.

　　3 讨论
　　
　　肾间质纤维化是各种原因引起的慢性肾脏疾病进展为终末期肾衰的共同途径[2]。近年研究表明TSP1是转化生长因子β1（TGFβ1）的活化因子， 在肾脏疾病中的重要作用越来越引起人们的关注。TSP1是一个Mr为450000的同源三聚体基质蛋白， 最初发现于血小板α颗粒内，随后被证明可由成纤维细胞、 内皮细胞、 血管平滑肌细胞和单核细胞等多种细胞分泌[3]。具有抑制新生血管生成， 促进凋亡， 活化TGFβ1等作用。本研究发现高糖刺激下， HK2细胞TSP1蛋白及mRNA表达明显增加， 甘露醇组无明显变化， 说明该作用与高糖导致的高渗透压无关。而RSG组TSP1的表达较高糖组明显减少。TSP1是TGFβ1促纤维化过程中的产物， 但同时又能活化TGFβ1， TSP1高表达于整个肾脏纤维化进程[4-6]。因而TSP1可能对TGFβ1的生物活性起正反馈作用。使得肾间质纤维化一旦发生， TSP1产生增加， 进一步加剧TGFβ1的活性， 导致病变持续进展， 是造成肾间质纤维化不可逆转， 持续发展的原因之一。本研究表明RGZ能通过拮抗TSP1的表达， 延缓高糖所致肾间质纤维化的进展。
　　
　　TGFβ1是导致肾间质纤维化的重要介质， 阻断TGFβ1活性曾一度被认为是防治肾间质纤维化最有前景的措施。但长期完全阻断TGFβ1可导致炎症或肿瘤发生[7]。TGFβ1下游的效应介质CTGF介导TGFβ1促纤维化活性的负面效应， 但并不介导TGFβ1抗炎症和抗增殖的作用[8， 9]。因此， 阻断或抑制CTGF的表达及其活性可能是更特异、 更有效的防治肾间质纤维化的措施。本研究结果提示高糖刺激下， HK2细胞CTGF蛋白及mRNA表达明显增加。而RSG组CTGF的表达较高糖组明显减少。说明RGZ能通过拮抗CTGF的表达， 延缓高糖所致肾间质纤维化的进展。CTGF可能是PPARγ激动剂抗糖尿病肾病过程中的又一靶目标。
　　
　　BMP7是新发现的肾脏内分泌激素， 是肾脏形态尤其是小管形态的维持蛋白， 外源性BMP7能明显减少小管上皮细胞和血管平滑肌细胞异常转分化为肌成纤维细胞， 减少炎症因子的表达和分泌， 从而减轻小管间质的急、 慢性病变。本研究发现在高糖作用下， 肾小管上皮细胞BMP7蛋白及mRNA表达明显降低， RSG干预下肾小管上皮细胞BMP7蛋白及mRNA表达上调。RSG增加BMP7表达的机制目前并不清楚， Dorai等[10]发现， 一些药物如视黄酸类药物和前列腺素E2类药物能上调BMP7受体基因的表达， 并证实它们还能增加内源性BMP7的表达。而视黄酸类物质恰恰是PPARγ异源性二聚体受体视黄酸X的配体， 一些前列腺素类的代谢产物又是PPARγ的内源性配体， 因此我们推测PPARγ途径的活化能上调BMP7的表达， 而RSG是PPARγ的特异性激动剂， 可能正是通过活化PPARγ而增加了肾组织BMP7的表达。
　　
　　本实验表明， 通过体外实验， RSG可能通过减少肾小管上皮细胞TSP1、 CTGF表达， 上调肾小管上皮细胞BMP7表达， 抑制糖尿病肾病肾间质纤维化的进展。

参考文献

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