HSP65PSA融合蛋白的体内外抗肿瘤活性研究

　　　　作者：董博翰， 吴秀丽， 尹晓光， 王莉， 卫红飞， 孙陆果， 于永利， 王丽颖

【摘要】 　　目的: 研究热休克蛋白65(HSP65)前列腺特异性抗原融合蛋白在体外对人树突状细胞的活化作用以及在小鼠体内抑制PSA阳性肿瘤细胞生长的作用。方法: 利用Western blot方法对融合蛋白HSP65PSA的特异性进行鉴定; 利用共聚焦显微镜、 流式细胞术（FCM）检测和斑点杂交的方法对PcDNA3GFPPSA稳定转染的B16细胞进行鉴定; 用HSP65PSA融合蛋白刺激来自于人外周血的未成熟树突状细胞， 观察融合蛋白对树突状细胞的体外活化作用; 用PcDNA3GFPPSA稳定转染的B16细胞种植C57BL/6小鼠， 继而用HSP65PSA融合蛋白来免疫小鼠以观察融合蛋白对PSA阳性B16肿瘤细胞生长的体内抑制作用。结果: Western blot检测显示融合蛋白HSP65PSA具有PSA蛋白特异性。共聚焦显微镜、 FCM检测和斑点杂交结果均显示PcDNA3GFPPSA转染的B16细胞转染情况良好。体外细胞实验显示， 将HSP65PSA融合蛋白作用于人外周血树突状细胞后可以明显促进树突状细胞表面分子CD86的表达， 其上调率为52.93%。动物体内实验显示， HSP65PSA融合蛋白可以明显抑制PSA阳性B16肿瘤细胞在小鼠体内的生长。10 μg蛋白免疫组的肿瘤体积（4.91±5.21）与对照组（10.56±6.10）相比差异有统计学意义（P&<0.05）。结论: HSP65PSA融合蛋白可以在体外活化树突状细胞， 在小鼠体内抑制PSA阳性B16肿瘤细胞的生长。HSP65PSA融合蛋白可能具有应用于PSA阳性肿瘤的免疫治疗作用。

【关键词】 HSP65 PSA融合蛋白 PSA阳性B16肿瘤细胞 免疫治疗 肿瘤生长抑制

　　肿瘤的免疫治疗正越来越多的为人们所关注。但现在的免疫治疗仍然存在一定的问题。首先， 免疫后的肿瘤抗原不能很好地激发机体的细胞免疫作用， 限制了抗肿瘤治疗的效果; 其次， 肿瘤抗原的免疫原性差，使其不易被免疫系统识别， 无法产生高效的免疫应答[1]; 另外， 肿瘤抗原的特异性也较差， 易产生毒副作用。研究发现热休克蛋白（heat shock protein， HSP）可以激发树突状细胞的交叉提呈能力引导外源性MHCI类肿瘤抗原表位进入细胞免疫途径， 从而使外源性抗原诱导机体产生更为强大的抗肿瘤免疫作用[2， 3]。而在众多肿瘤抗原中， 前列腺特异性抗原（prostate specific antigen， PSA）是一种主要表达在前列腺癌组织中的肿瘤特异性抗原， 在正常的前列腺组织及其他组织中其表达量很少。这决定了PSA蛋白可以作为一种外源性肿瘤抗原应用于抗肿瘤的免疫治疗， 将其免疫机体后所产生的抗肿瘤免疫作用将具有较高的特异性且副作用更小[4]。故我们利用基因工程的方法将结核杆菌来源的HSP65和人PSA的部分MHCI抗原表位连接在一起， 并表达和纯化出了HSP65PSA融合蛋白。本实验中对这种融合蛋白的性质进行了鉴定， 并通过体外的细胞实验和体内的动物实验观察HSP65PSA融合蛋白的免疫激活活性以及其在小鼠体内抑制PSA阳性肿瘤细胞生长的作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 HSP65PSA融合蛋白由本室自己表达纯化。羊抗人PSA单克隆抗体（mAb）购自Biodesign公司。HRP标记驴抗羊IgG购自北京鼎国生物技术有限公司。PcDNA3GFPPSA真核表达载体由本室构建， PcDNA3GFPPSA稳定转染的黑色素瘤细胞株（B16/PcDNA3GFPPSA）由本室建立。健康人浓缩白细胞来源于长春市中心血站。淋巴细胞分离液由中国医学科学院生物工程研究所灏洋生物技术有限公司生产。6～8周龄的雄性C57BL/6小鼠购于北京维通利华实验动物有限公司。共聚焦显微镜购自日本奥林巴斯公司。流式细胞仪购自美国BD公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 对HSP65PSA融合蛋白进行Western blot鉴定 将融合蛋白HSP65PSA用PBS稀释后取5 μg上样， 同时取5 μg牛血清白蛋白（BSA）上样作为阴性对照， 然后进行120 g/L 的SDSPAGE电泳， 电泳完毕后把蛋白转移到硝酸纤维素膜上， 用50 g/L脱脂奶粉（1×PBS配制） 4℃封闭过夜， 加入羊抗人PSA mAb， 室温孵育2 h， 1×PBS洗膜3次， 每次10 min; 加入HRP标记驴抗羊IgG， 室温孵育2 h， 1×PBS洗膜3次， 每次10 min， DAB显色。

　　1.2.2 对PcDNA3GFPPSA转染的B16细胞进行鉴定 （1）共聚集显微镜鉴定: 细胞培养于含100 mL/L小牛血清和10 g/L G418的IMDM培养液中， 在37℃、 50 mL/L CO2孵箱中培养， 细胞呈单层贴壁生长， 每2～3 d传代1次。培养瓶中生长状态良好的细胞可直接在共聚焦显微镜下观察绿色荧光。（2）FCM鉴定: 将生长状态良好的B16/PcDNA3GFPPSA细胞用2.5 g/L的胰酶消化， 加入无血清IMDM制备单细胞悬液并调整细胞数为1×105/mL， 取500 μL单细胞悬液， 1×PBS洗2次， 滤网过滤1次后进行FCM检测。（3）斑点杂交法鉴定: 将生长状态良好的B16/PcDNA3GFPPSA细胞用2.5 g/L的胰酶消化， 加入无血清IMDM制备单细胞悬液并调整细胞数为2×109/L， 离心收集细胞， 加入100 μL细胞裂解液， 在沸水中煮5 min， 离心收集上清， 以上清原液、 原液2倍稀释、 原液4倍稀释、 原液8倍稀释4个浓度用负压泵抽滤在硝酸纤维素膜上， 同时以相同的方法取未转染的B16细胞上清和HSP65PSA融合蛋白溶液分别作为阴性对照和阳性对照， 点膜后的硝纤膜用50 g/L脱脂奶粉（1×PBS配制） 4℃封闭过夜， 加入羊抗人PSA mAb， 室温孵育2 h， 1×PBS洗膜3次， 每次10 min， 加入HRP标记驴抗羊IgG， 室温孵育2 h， 1×PBS洗膜3次， 每次10 min， DAB显色。

　　1.2.3 HSP65PSA融合蛋白对人外周血树突状细胞的免疫激活作用 将一单位的浓缩白细胞加入到50 mL PBS/EDTA缓冲液中， 并补充缓冲液总体积到100 mL， 将血/PBS/EDTA混合液沿管壁缓慢加入到含淋巴细胞分离液（2∶1）的离心管中， 3000 r/min离心25 min， 将上层血浆吸净后， 用滴管吸取位于中间界面的单个核细胞， 加入适量冷PBS/EDTA/血清缓冲液， 以1800 r/min的速度和1200 r/min的速度分别离心10 min， 离心管内的细胞用含100 mL/L 人AB血清的IMDM稀释后， 铺24孔板， 放于37℃、 50 mL/L CO2孵箱中培养。2 h后吸出上清液中的非黏附细胞， 加1 mL完全培养液（含10 mL/L人AB血清、 200 U/mL IL4、 100 μg/L GMCSF的IMDM培养液）， 放于37℃、 50 mL/L CO2孵箱中继续培养， 每3 d半换液1次， 新培养液中含2倍浓度的GMCSF和IL4， 7 d后于不同的细胞培养孔中分别加入HSP65PSA融合蛋白（100 mg/L）、 成熟因子（10 μg/L IL6、 1 mg/L PGE2、 10 μg/L TNFα ）、 LPS[5Eu/mL（1 μg/L）]、 LPS抑制剂（多黏菌素B）+HSP65PSA融合蛋白（1 mg/L+100 mg/L）， 并设未加任何处理因素的阴性对照孔， 第8天收获各孔中的细胞于不同的离心管中， 分别加入无血清IMDM， 1200 r/min， 每次5 min离心洗涤细胞2次， 再于每管加入FITC抗人CD86抗体， 并取一部分未加处理的细胞加入FITCIgG1作为FCM检测的设门细胞， 闭光冰上摇30 min， 1×PBS离心洗2次， 用PBS/EDTA悬浮细胞后立即进行FCM检测。

　　1.2.4 HSP65PSA融合蛋白抑制PSA阳性B16肿瘤细胞生长的体内实验 在C57BL/6小鼠右侧背下部靠近尾根部约0.7 cm处皮下注射3×105/0.2 mL 1×PBS B16/Pc DNA3GFPPSA细胞， 注射局部出现直径6～8 mm的皮丘， 视为接种成功。实验分组: 待全部小鼠都出瘤后， 将40只小鼠随机分为5组， 每组8只小鼠（1）PBS溶媒对照组: 第1、 3、 7、 14天于小鼠四肢靠近淋巴结处4点皮下注射200 μL1×PBS溶液， 50 μL/点; （2）未加处理因素对照组: 接种肿瘤后不加任何处理; （3）1 μg HSP65PSA融合蛋白治疗组: 第1、 3、 7、 14天于小鼠四肢靠近淋巴结处4点皮下注射HSP65PSA融合蛋白1 μg/200 μL1×PBS， 50 μL/点; （4）10 μg HSP65PSA融合蛋白治疗组: 第1、 3、 7、 14天于小鼠四肢靠近淋巴结处4点皮下注射HSP65PSA融合蛋白10 μg/200 μL1×PBS， 50 μL/点; （5）100 μg HSP65PSA融合蛋白治疗组: 第1、 3、 7、 14天于小鼠四肢靠近淋巴结处四点皮下注射HSP65PSA融合100 μg/200 μL1×PBS， 50 μL/点。给药后每隔3 d测量肿瘤体积。肿瘤体积（V）按公式V=1/2ab2(a=瘤长， b=瘤宽)计算， 并绘制肿瘤生长曲线。

　　1.2.5 统计学处理 实验数据均以x±s表示， 显著性检验采用完全随机分组t检验和方差分析。

　　2 结果

　　2.1 HSP65PSA融合蛋白的鉴定 Western blot结果显示融合蛋白可以和抗PSA mAb结合（图1B）。融合蛋白的Mr约为87000（图1A）， 与理论计算值吻合， 对照上样孔未出现条带。

　　图1 HSP65PSA蛋白的Western blot分析（略）

　　A: SDSPAGE结果; 1: Protein marker; 2: HSP65PSA; 3: BSA. B: Western blot; 4: HSP65PSA; 5: BSA.

　　2.2 B16/PcDNA3GFPPSA细胞的转染结果 在共聚焦显微镜下可见90%细胞发出明亮的绿色荧光（图2）， 转染率较高。FCM检测结果与未转染的B16细胞相比较， B16/PcDNA3GFPPSA转染细胞的转染效率为63.13%。斑点杂交结果显示B16/Pc DNA3GFPPSA细胞裂解上清液中含有可以和抗PSA mAb结合的蛋白， 阴性对照上样点未显色（图3）。

　　图2 转染细胞共聚焦显微镜图片（×40）（略）

　　A: 激发绿色荧光; B: 普通光镜; C: A、 B图像重合.

　　图3 斑点杂交检测转染细胞（略）

　　A: 未转染外源基因的B16细胞; B: HSP65PSA融合蛋白; C: PcDNA3GFPPSA转染的B16细胞.

　　2.3 HSP65PSA对人树突状细胞表面CD86表达的影响 FCM测定显示， 与对照细胞比较， 加入融合蛋白HSP65PSA后树突状细胞表面CD86分子的表达发生了明显的上调， 上调率为52.93%， 这提示融合蛋白可以促进树突状细胞的成熟。同时我们也发现融合蛋白中的LPS杂质也可以在一定程度上促进树突状细胞表面CD86分子表达的上调， 上调率为27.77%， 但融合蛋白中的主要促CD86上调作用还是由其中的HSP65PSA蛋白成分引起的， 其对CD86分子的上调率为38.60%。与溶媒对照有统计学意义（P&<0.05）。

　　2.4 HSP65PSA融合蛋白抑制PSA阳性B16肿瘤细胞的体内实验 B16/Pc DNA3GFPPSA细胞接种于C57BL/6小鼠14 d后， 可在皮下摸到栗粒大小结节， 以后逐渐增大。所有移植肿瘤的小鼠均见肿瘤生长， 移植成瘤率为100%。每隔3 d测量1次肿瘤体积， 以时间为横坐标， 肿瘤体积为纵坐标做肿瘤生长曲线图（图4）。PBS阴性对照组肿瘤最大平均体积为（10.56±6.10） cm3， 未处理组肿瘤最大平均体积为（13.18±6.36） cm3， 1 μg HSP65PSA融合蛋白治疗组肿瘤最大平均体积为（10.55±4.51） cm3， 10 μg HSP65PSA融合蛋白治疗组肿瘤最大平均体积为（4.91±5.21） cm3， 100 μg HSP65PSA融合蛋白治疗组肿瘤最大平均体积为（6.52±3.60） cm3。其中只有10 μg HSP65PSA融合蛋白治疗组的肿瘤最大平均体积同PBS阴性对照和未处理组相比差异具有统计学意义（P&<0.05）。从曲线中可以看出10 μg HSP65PSA融合蛋白的免疫可以明显降低肿瘤生长速度， 抑制肿瘤的生长。10 μg HSP65PSA融合蛋白治疗组的肿瘤体积抑瘤率为53.50%， 而1 μg HSP65PSA融合蛋白治疗组和100 μg HSP65PSA融合蛋白治疗组的肿瘤体积抑瘤率分别为0.09%和38.26%。只有10 μg HSP65PSA融合蛋白治疗组的肿瘤体积抑瘤率与PBS对照组相比差异具有统计学意义（P&<0.05）。此外， PBS对照组的肿瘤最大平均体积同未处理组相比差异不具有统计学意义（P&>0.05）， 因此将PBS作为溶媒对照是合理的。

　　图4 小鼠的肿瘤生长曲线（略）

　　3 讨论
　　
　　单纯的外源性肿瘤抗原免疫机体后通常只能诱导体液免疫反应， 而在肿瘤免疫中发挥主要作用的通常是细胞免疫反应[5， 6]。因此很多研究都希望找到一种方法将外源性的肿瘤抗原引入到细胞免疫途径中。研究发现， HSP可以通过活化树突状细胞将外源性MHCI类肿瘤抗原表位引导入细胞免疫途径， 并因此激活抗原特异性的CTL去攻击、 杀灭相应的肿瘤细胞[7， 8]。本实验中将HSP65同PSA的部分MHCI类抗原表位连接在一起制成了一种融合蛋白， 希望这种融合蛋白可以诱导机体产生针对PSA阳性肿瘤细胞的抗肿瘤免疫作用。
　　
　　实验中我们从人的浓缩白细胞中提取了树突状细胞， 并用融合蛋白HSP65PSA在体外作用于未成熟的树突状细胞。通过对树突状细胞表面分子CD86的表达情况的检测， 我们发现我们的融合蛋白可以明显的促进树突状细胞表面分子CD86的表达。这说明融合蛋白HSP65PSA可以促进树突状细胞的成熟， 这种成熟的树突状细胞具有更好的抗原提呈能力， 这将有利于抗肿瘤免疫反应的发生。将融合蛋白以不同剂量免疫C57BL/6荷瘤小鼠后， 我们发现10 μg融合蛋白治疗组小鼠的肿瘤生长受到明显的抑制， 而1 μg和100 μg融合蛋白治疗组小鼠的肿瘤生长趋势并未受到明显影响。这说明10 μg HSP65PSA融合蛋白的免疫在小鼠体内产生了抑制PSA阳性肿瘤细胞生长的作用， 且并非免疫的蛋白量越大抑瘤效果越好， 这一剂量将可能成为治疗PSA阳性肿瘤的有效剂量。
　　
　　肿瘤抗原一直是抗肿瘤免疫研究的热点， 如何将外源性肿瘤抗原引入细胞免疫途径是抗肿瘤免疫治疗成败的关键。本实验中设计合成了一种HSP65PSA融合蛋白并通过相应的实验结果表明这种融合蛋白具有促进树突状细胞活化、 成熟的作用， 而且在小鼠体内产生了特异性的抗肿瘤作用。近年来， 已经有一些研究发现将HSP和肿瘤抗原制成融合蛋白并利用它进行肿瘤的免疫治疗是可行的[9]。本实验中也初步证明了HSP65PSA融合蛋白的免疫激活活性和在小鼠体内的抗肿瘤作用。这种融合蛋白将可以应用于前列腺癌等表达PSA抗原的肿瘤的治疗， 从而成为一种新颖的肿瘤免疫治疗方式。

参考文献

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