【摘要】 目的: 观察华支睾吸虫溶血磷脂酶（CslysoPLA）重组蛋白体外对大鼠肝星状细胞和卵圆细胞的作用。方法: 应用免疫荧光方法， 观察CslysoPLA重组蛋白是否可与大鼠肝星状细胞和卵圆细胞膜结合; 应用MTT方法， 测定CslysoPLA重组蛋白对大鼠肝星状细胞和卵圆细胞的促增殖作用; 应用流式细胞术（FCM）检测CslysoPLA重组蛋白对大鼠卵圆细胞细胞周期的影响。结果: CslysoPLA重组蛋白可与大鼠肝星状细胞和卵圆细胞膜结合， MTT方法测定结果表明低浓度重组蛋白对大鼠肝星状细胞和卵圆细胞有一定促增殖作用(P&<0.05)， 20 mg/L重组蛋白可促进大鼠卵圆细胞进入G2期， 但高浓度重组蛋白可导致大鼠肝星状细胞和卵圆细胞死亡。结论: 低浓度的CslysoPLA重组蛋白在体外可刺激大鼠肝星状细胞和卵圆细胞增殖， 表明CslysoPLA可能是华支睾吸虫导致胆管上皮增生、 腺瘤样病变和肝纤维化的效应分子之一。而高浓度的CslysoPLA重组蛋白可引起肝星状细胞和卵圆细胞死亡， 表明CslysoPLA亦可能是华支睾吸虫引起的化学损伤的毒力因子之一。
【关键词】 华支睾吸虫 溶血磷脂酶 肝星状细胞 卵圆细胞
华支睾吸虫病（clonorchiasis）亦称肝吸虫病， 是由华支睾吸虫（Clonorchis sinensis， C. sinensis）感染引起的一种食源性人兽共患寄生虫病。华支睾吸虫成虫寄生于人和其他保虫宿主的肝胆管内， 虫体分泌物或代谢产物的化学性刺激及虫体本身的机械性刺激， 可引起胆管局限性扩张、 胆管上皮细胞增生、 管壁增厚、 管腔狭窄等病理改变， 临床上可诱发胆管炎、 胆囊炎、 胆管肝炎、 肝纤维化甚至肝胆管肿瘤［1］。在感染华支睾吸虫的大鼠模型中， 华支睾吸虫合并化学致癌剂20～25周可以诱发大鼠出现肝细胞癌和胆管癌［2， 3］。其致癌机制可能是: （1）虫体长期寄生在胆管内， 导致胆管上皮细胞增生和脱落， 并易继发细菌感染; （2）虫体代谢产物及成虫死亡降解产物所致的化学刺激; （3）与其他因素协同作用， 如致癌物以及机体本身的营养、 免疫、 遗传等因素导致胆管上皮细胞发育不良［4］。虽然流行病学和动物实验结果均表明华支睾吸虫感染是原发性肝胆管癌的病因， 但还有很多问题尚未清楚， 二者之间的直接因果关系尚未得到证明。目前， 有关华支睾吸虫致病机制的了解多源于流行病学调查和临床观察， 对其致病机制的研究很有限。因此， 对华支睾吸虫的分子致病机制研究， 特别是阐明华支睾吸虫感染引起的肝胆管炎症、 腺瘤样增生和癌变的分子机制对防治华支睾吸虫病意义非常重大。我们通过基因工程方法获得了华支睾吸虫溶血磷脂酶(Lysophospholipase of Clornorchis sinensis， CslysoPLA)重组蛋白， 并用Western blot方法初步证实它存在于华支睾吸虫的分泌/排泄抗原中， 且具有磷脂酶A和溶血磷脂酶的活性［5］。在此基础上， 现对CslysoPLA重组蛋白对大鼠肝星状细胞和卵圆细胞的体外作用进行了分析， 以进一步了解CslysoPLA作为分泌/排泄蛋白， 在虫体致病方面所起的作用。
1 材料和方法
1.1 材料 细胞核荧光染料Hoechst 33324为Sigma公司产品; 橙红色荧光标记的抗体（Alexa Fluor 555羊抗大鼠IgG）为Molecular Probes公司产品; MTT为MBCHEM公司产品; 胎牛血清（FCS）为杭州四季青公司产品。大鼠肝卵圆细胞（oval cell）由中山大学病理学教研室薛玲老师惠赠， 实验所用的卵圆细胞为第25～28代。大鼠肝星状细胞（hepatic stellate cell， HSC）由中山大学动物中心提供。
1.2 方法
1.2.1 CslysoPLA重组蛋白结合大鼠肝星状细胞膜和卵圆细胞膜的免疫细胞化学实验 将大鼠肝星状细胞和卵圆细胞分别铺于24孔细胞培养板， 37℃培养过夜。用无血清培养液洗涤3次， 加入含50 mL/L牛血清白蛋白（BSA）的无血清培养液， 37℃放置120 min。洗涤后， 加入CslysoPLA重组蛋白， 蛋白终浓度为10 mg/L， 37℃放置120 min。洗涤后， 加入用含10 mL/L BSA的无血清培养液1∶200稀释的一抗（分别为免疫重组蛋白的大鼠血清， 重组蛋白免疫前大鼠的阴性血清［5］）， 37℃放置120 min。再加入橙红色荧光二抗（1∶400稀释）37℃放置30 min。最后加入Hoechst， 置荧光显微镜下观察（激发光分别330～385 nm和530～550 nm）。
1.2.2 MTT方法检测大鼠肝星状细胞和卵圆细胞增殖 收集细胞， 用常规培养液配成单个细胞悬液， 细胞计数后稀释至细胞5×107/L， 接种于96孔板， 置于CO2培养箱， 37℃培养过夜。分6组分别加入含2 mg/L、 20 mg/L、 200 mg/L CslysoPLA重组蛋白的20 mL/L FCS培养液， 对照组为含20 mL/L FCS培养液、 含20 mg/L和200 mg/L SjGST(日本血吸虫谷胱苷肽S转移酶)重组蛋白的20 mL/L FCS的培养液。每组做16个平行对照孔， 分别于培养12、 24、 36 h， 每孔加入适量的5 g/L MTT， 37℃继续培养3.5 h， 然后弃尽培养液， 每孔加入150 μL DMSO， 振荡使结晶物充分溶解。选择492 nm波长， 用全自动酶标仪测定各孔吸光度值， 记录结果。
1.2.3 流式细胞术(FCM)对大鼠卵圆细胞周期的检测 收集细胞， 用常规培养液配成单个细胞悬液， 细胞计数后稀释至细胞1×108/L， 再将稀释的细胞悬液同时等量接种于10 mL培养瓶， 37℃培养过夜。再换成无血清培养液， 培养48 h。分2大组分别加入含20 mL/L FCS的培养液， 含20 mg/L重组蛋白的20 mL/L FCS培养液， 每组做3个平行孔。培养30 h， 1 500 r/min 离心4 min， 收获细胞， PBS洗涤， 离心去上清， 加1 mL冰预冷700 mL/L乙醇， 4℃固定细胞24 h， 加入1 mL PI染色液， 用流式细胞仪对细胞进行自动分析和计数。
1.2.4 统计学分析 资料以x±s表示， 应用SPSS13.0软件包的重复测量方差分析方法、 StudentNewmanKeuls方法和t检验方法分析。
2 结果
2.1 CslysoPLA重组蛋白结合于大鼠肝星状细胞膜的免疫化学实验 当重组蛋白与HSC共同孵育后， 用免疫重组蛋白的大鼠血清为一抗时， HSC细胞膜可见较强的橙红色荧光（图1B）， 用大鼠阴性血清为一抗， 则HSC细胞膜未见橙红色荧光（图1A）。为排除橙红色荧光抗体、 一抗阳性血清中某些成分能够非特异结合于HSC细胞膜而造成的假阳性结果， 同时设立了相应的对照组。发现若HSC只与重组蛋白孵育而不加入一抗， HSC细胞膜未见橙红色荧光（图1C）; 但若HSC不与重组蛋白孵育而直接加入免疫重组蛋白的大鼠血清， HSC细胞膜可见微弱的橙红色荧光（图1D）， 这表明HSC细胞膜上存在能够与重组蛋白抗体结合的抗原。实验结果表明CslysoPLA重组蛋白可结合于大鼠HSC膜。
2.2 CslysoPLA重组蛋白结合于大鼠肝卵圆细胞膜的免疫化学实验 当重组蛋白与卵圆细胞共同孵育后， 用免疫重组蛋白的大鼠血清为一抗时， 卵圆细胞膜可见较强的橙红色荧光（图2B）， 用大鼠阴性血清为一抗， 则卵圆细胞膜未见橙红色荧光（图2A）。同样为排除橙红色荧光抗体、 一抗阳性血清中某些成分非特异结合于卵圆细胞膜而造成的假阳性结果， 亦设立了相应的对照组， 卵圆细胞膜均未见橙红色荧光（图2C， D）， 实验结果表明CslysoPLA重组蛋白可结合于大鼠卵圆细胞膜。
2.3 CslysoPLA重组蛋白对大鼠肝星状细胞增殖的影响 MTT实验结果数据应用SPSS13.0软件包的重复测量方差分析方法， 经球对称检验符合球对称(P=0.365)， 在时间上HSC增殖有统计学意义（P&<0.01）; 在时间变量控制情况下， 应用StudentNewmanKeuls方法， 4组之间有统计学意义（P&<0.05）。从实验结果分析， 2 mg/L的重组蛋白在24 h和36 h可刺激HSC增殖; 20 mg/L的重组蛋白在12、 24、 36 h均可刺激HSC增殖， 增殖作用高于2 mg/L的重组蛋白， 而且其对HSC增殖作用亦高于相同浓度的SjGST蛋白对HSC的增殖作用（图3）。另外， 当200 mg/L重组蛋白与HSC孵育24 h后， 细胞死亡较多。与此对照的200 mg/L SjGST蛋白对HSC则无损伤作用， 即排除了细菌表达的蛋白中内毒素对细胞造成的损害作用。
图1 CslysoPLA重组蛋白结合于大鼠肝星状细胞膜（略）
Fig 1 Immunofluorescence assay of the recombinant CslysoPLA binding the membrane of HSCs of rat（×200)
A: HSCs were incubated with the recombinant protein and the sera from the normal rats as the first Ab; B: HSCs were incubated with the recombinant protein and the sera from the rats immunized with the recombinant protein as the first Ab; C: HSCs were incubated with the recombinant protein without the first Ab; D: HSCs were incubated with the sera from the rats immunized with the recombinant protein as the first Ab without incubated with the recombinant protein.
图2 CslysoPLA重组蛋白结合于大鼠卵圆细胞膜（略）
Fig 2 Immunofluorescence assay of the recombinant CslysoPLA binding the membrane of oval cells of rat（×200)
A: Oval cells were incubated with the recombinant protein and the sera from the normal rats as the first Ab; B: Oval cells were incubated with the recombinant protein and the sera from the rats immunized with the recombinant protein as the first Ab; C: Oval cells were incubated with the recombinant protein without the first Ab; D: Oval cells were incubated with the sera from the rats immunized with the recombinant protein as the first Ab without incubated with the recombinant protein.
图 3 CslysoPLA重组蛋白对大鼠肝星状细胞增殖的影响（略）
Fig 3 The effects of the recombinant CslysoPLA on the proliferation of hepatic stellate cells of rat
2.4 CslysoPLA重组蛋白对大鼠卵圆细胞增殖的影响 方法同上， 经球对称检验符合球对称（P=0.328）， 在时间上卵圆细胞细胞增殖有统计学意义（P&<0.01）; 在时间变量控制情况下， 应用StudentNewmanKeuls方法， 4组之间均有统计学意义（P&<0.05）。从实验结果分析， CslysoPLA重组蛋白在低浓度（2 mg/L、 20 mg/L）情况下均可刺激大鼠卵圆细胞增殖， 在重组蛋白为20 mg/L时， 对卵圆细胞增殖作用最明显， 其对卵圆细胞增殖作用高于相同浓度的SjGST蛋白对卵圆细胞的增殖作用（图4）。另外， 当200 mg/L重组蛋白与卵圆细胞孵育24 h后， 细胞死亡同样较多。与此对照的200 mg/L SjGST蛋白对卵圆细胞无损伤作用。
图4 CslysoPLA重组蛋白对大鼠卵圆细胞增殖的影响（略）
Fig 4 The effects of the recombinant CslysoPLA on the proliferation of oval cells of rat
2.5 FCM对大鼠卵圆细胞周期的检测 FCM分析结果表明20 mg/L重组蛋白与细胞孵育30 h后， G1、 G2、 S期细胞所占比例分别为(62.433±2.719)%、 (23.867±1.936)%、 (13.567±0.917)%; 20 mg/L FCS对照组作用于细胞， G1、 G2、 S期细胞所占比例分别为(70.767±1.746)%、 (11.633±1.970)%、 (17.567±0.525)%， 结果表明20 mg/L重组蛋白可促进卵圆细胞进入G2期， 与对照组有明显性差异（用SPSS13.0软件包的t检验分析， P&<0.05）。
3 讨论
HSC是一种具有多潜能的幼稚间质细胞， 是肝间质细胞中兼有肌细胞、 成纤维细胞及脂肪细胞性质的一种细胞， HSC的激活、 增殖是肝纤维化的关键［6］。卵圆细胞存在于小叶间胆管或Hering管， 在形态及超微结构上相似于胆管上皮细胞， 但在酶化学、 免疫组织化学、 生物化学及分子生物学等方面同时兼备胆管上皮细胞和肝细胞的许多表型特点［7， 8］。 卵圆细胞与肝癌存在许多相似点及内在联系， 由致癌剂或癌基因诱导卵圆细胞转化后可形成肝细胞癌、 胆管上皮癌和未分化癌［9］。在感染华支睾吸虫的动物模型中， 华支睾吸虫合并二乙基亚硝胺能刺激胆管周围的卵圆细胞、 胆管细胞和肝细胞增殖， 进而继发肝外胆管癌［10， 11］。Yoon等［12］报道从感染华支睾吸虫并同时使用化学致癌剂诱导仓鼠发生胆管癌变的动物模型中分离出卵圆细胞， 体外培养2周后， 发现卵圆细胞向胆管上皮细胞分化， 部分证实了华支睾吸虫的分泌/排泄抗原可刺激卵圆细胞增殖、 分化并最终导致胆管细胞癌的发生。
鉴于此， 我们设想既然CslysoPLA是华支睾吸虫的主要分泌/排泄蛋白之一， 又具有磷脂酶A和溶血磷脂酶的活性， 有可能是华支睾吸虫致病因子。我们选择了肝星状细胞和卵圆细胞为研究平台， 通过观察重组蛋白对它们的作用， 初步探讨CslysoPLA在华支睾吸虫致病过程中所起的作用。通过免疫细胞化学法实验， 证实了CslysoPLA重组蛋白可结合于大鼠肝星状细胞和卵圆细胞膜。文献报道磷脂酶A2可以通过受体结合于细胞膜或者直接与细胞膜上的底物（膜的磷脂）结合［13， 14］， 那么， CslysoPLA重组蛋白亦有可能通过相应的受体结合于2种细胞膜或者直接与细胞膜上的底物结合。MTT实验结果表明， 低浓度的CslysoPLA重组蛋白在体外可以刺激大鼠肝星状细胞和卵圆细胞增殖， 尤其对卵圆细胞增殖作用较明显。为了进一步验证低浓度重组蛋白可刺激细胞增殖， 我们选择对细胞增殖作用最明显的20 mg/L重组蛋白对大鼠卵圆细胞作用这一组， 用FCM分析重组蛋白对细胞周期的影响。结果表明20 mg/L重组蛋白与卵圆细胞孵育30 h， 可促进细胞进入G2期， 从而使细胞增殖。但高浓度重组蛋白却可导致大鼠肝星状细胞和细胞死亡。这与Mora等［15］报道的一个来自Bothrops asper蛇毒液的PLA2在体外作用于类淋巴细胞的结果是一致的， Mora等发现该PLA2蛋白浓度为0.5～5.0 μg/L， 可刺激细胞增殖; 蛋白浓度为5～25 μg/L， 诱导细胞凋亡; 蛋白浓度为&>25 μg/L， 破坏细胞膜， 导致细胞死亡。结合MTT实验结果， 推测当华支睾吸虫寄生于宿主体内数量不多时， 华支睾吸虫产生的CslysoPLA的量比较低， 低浓度的CslysoPLA可刺激卵圆细胞和肝星状细胞或其他细胞增殖， 即CslysoPLA可能是导致胆管上皮增生、 腺瘤样病变和肝纤维化的效应分子之一。而当华支睾吸虫寄生于宿主体内数量多时， 华支睾吸虫产生的CslysoPLA的量比较高， 高浓度的CslysoPLA可破坏卵圆细胞和肝星状细胞以及其他细胞膜， 导致组织坏死， 表明CslysoPLA亦可能是华支睾吸虫引起的化学损伤的毒力因子之一。
近年来的研究发现胞浆型PLA2(cPLA2)除了在炎症中起重要作用外， 与细胞的增殖也有密切关系［16］。CslysoPLA重组蛋白具有磷脂酶A的活性， 在体外低浓度的该蛋白可刺激大鼠肝星状细胞和卵圆细胞增殖， 是否与cPLA2活化引起细胞增殖机制相同， 还需进一步研究。在体外低浓度的CslysoPLA重组蛋白可刺激大鼠卵圆细胞增殖， 但是否使卵圆细胞向胆管上皮细胞分化， 亦需进一步实验验证。
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