IL12+重组卡介苗对新生期小鼠脾脏T细胞功能亚群发育的影响

　　　　 作者：何云， 刘恩梅*， 杨锡强， 李欣， 刘玮

【摘要】 　　目的: 研究IL12+重组BCG新生期接种对小鼠脾脏T细胞功能亚群发育的影响。 方法: 新生清洁级BALB/c小鼠24只， 分对照组、 BCG组和IL12+重组BCG组。新生期接种， 4周后取脾细胞用流式细胞术检测CD3+CD8+IFNγ+、 CD3+CD8-IFNγ+、 CD3+CD8+IL４+、 CD3+CD8-IL４+、 CD4+Foxp3+ T细胞的比例， 其分别代表Tc1、 Th1、 Tc2、 Th3和调节性T细胞亚群。 结果: BCG组、 IL12+重组BCG组Th1、 Tc1细胞比例明显高于对照组（P&<0.05或P&<0.01）， BCG组与IL12+重组BCG组比较没有统计学意义; Tc2、 Th3和调节性T细胞比例各组间比较没有统计学意义; 二接种组Th1/Th3、 Tc1/Tc2和总IFNγ/IL4比值明显高于对照组（P&<0.05或P&<0.01）; CD4+Foxp3+ T细胞比例各组间比较没有统计学意义(P&>0.05)。结论: 新生期BCG和IL12+重组BCG接种组接种均能促进Th1、 Tc1细胞亚群的发育， 提高Th1/Th3、 Tc1/Tc2比值， 但不能影响CD4+FoxP3+Treg细胞的比例。

【关键词】 卡介苗 白细胞介素12 T细胞亚群 调节性T细胞

　　［Abstract］ AIM: To explore the effects of recombinant Balillus CalmetteGuerin secreting IL12 on the development of spleen T cell subsets of neonatal BALB/c mice. METHODS: Twentyfour neonatal BALB/c mices were pided 3 groups: Control， BCG ， rBCG groups， which inoculated with BCG and rBCG intraperiotoneally within 2-3 days after birth. Four weeks later， spleen cells of mice were isolated and the percentage of CD3+CD8+IFNγ+/CD3+CD8IFNγ+/CD3+CD8+IL４+/ CD3+CD8-IL４+/ CD4+Foxp3+ T cells ， which represent Tc1/Th1/Tc2/Th3/Treg cells respectively were detected by flow cytometry at single cells level， and Th1/Th3， Tc1/Tc2 ratio were calculated. RESULTS: The percentages of Th1， Tc1 cell of BCGvaccinated mice， rBCG vaccinated mice were significant higher than control mice (P&<0.01)， and there was no difference between the two vaccinated groups. The ratio of Th1/Th3， Tc1/Tc2 and total IFNγ/IL４ of two vaccinated groups were higher than control group. The percentages of Treg cells were no difference among the three groups (P&>0.05). CONCLUSION: Neonatal BCG and rBCGvaccination can significantly increase Tc1 and Th1 cells and Th1/Th3， Tc1/Tc2 ratio in spleen cells. Neonatal BCG and rBCG vaccination may have an same effects on development of T cell subsets in neonatal BALB/c mice. The percentage of CD4+Foxp3+ T cells among three groups were no significant difference.

　　［Keywords］bacillus calmetteguerin; interleukin12; T cells subsets; regulatory T cell

　　卡介苗（bacillus calmetteguerin， BCG）可通过诱导Th1/Tr免疫应答而保护哮喘， 我们前期研究发现呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus， RSV）能逆转新生期BCG接种的抗哮喘作用， 其机制尚不清楚［1， 2］。IL12是Th1分化发育的关键细胞因子。皮下注射重组IL12能减少哮喘患者嗜酸性粒细胞水平， 但降低气道高反应性的作用不明显， 也不能改善随后的哮喘症状， 并有严重的副作用［3］。我们将IL12与BCG重组后能避免直接使用重组IL12的副作用， 又能增强BCG的Th1/Tr应答， 并分别以CD3+CD8+IFNγ+、 CD3+CD8-IFNγ+、 CD3+CD8+IL4+、 CD3+CD8-IL４+、 CD4+Foxp3+ T细胞代表Tc1、 Th1、 Tc2、 Th3及T调节性细胞水平， 在单细胞水平观察IL12+重组BCG在新生期接种对小鼠脾脏细胞亚群发育的影响。

　　1 材料和方法

　　1．1 材料 清洁级BALB/c小鼠购自重庆医科大学实验动物中心， 饲养于专用消毒饲养盒内， 恒定室温。过滤空气， 饲料、 水皆经消毒处理， 更换饲料等操作在超净台内进行。新生2～3 d小鼠共24只， 分为对照组、 BCG组和IL12+重组BCG接种组， 每组8只。BCG组给以BCG(上海生物制品研究所， 批号2005030211， 购于重庆市渝中区疾控中心)1×105CFU/只腹腔、 皮下联合注射; IL12+重组BCG以rBCG 1×105CFU/只腹腔、 皮下联合注射; 生后满4周无菌取脾脏进行流式细胞仪检测。

　　1.2 方法

　　1．2．1 IL12+重组BCG的构建及鉴定 先构建表达IL12的穿梭质粒， 并将其转化入BCG(本部分实验由重庆医科大学微生物教研室完成)。

　　1．2．2 胞内细胞因子（IFNγ、 IL４）的流式检测 无菌取脾， 在300目不锈钢网上少量PBS冲洗下轻轻研磨制成单细胞悬液， RBC裂解液裂解红细胞， PBS洗2次， 细胞悬浮与RPMI1640（含100 mL/L FBS）， 调整细胞密度为2×109/L， 台盼兰染色计数活细胞数在95%以上。取1 mL脾细胞（2×109/L加入7.5 μL 1 mg/L 佛波酯(PMA) 工作液、 6 L 50 mg/L 离子霉素(Ionomycin)工作液、 1000 U/L BD GolgiStopTM蛋白转运抑制剂（内含Monensin 2.0 μmol/L终浓度）， 混匀， 37℃ 50 mL/L CO2培养箱培养6 h， PBS洗2次， 加入0.75 μg Ratantimouse CD3: PECy5、 1.5 μg Ratantimouse CD8FITC (荧光抗体均为BD Parmigen公司产品， 下同)， 室温避光孵育15 min， 分成3管， 每管100 μL已染色的脾细胞， 加入500 μL Fix＆perm 中的固定液室温避光孵育15 min， 再加入100 μL Fix＆perm 中溶血破膜液， 1 200 r/min， 洗2次， 加100 μL大鼠血清封闭30 min， 同时分别加入RatIgG1 controlPE、 Ratantimouse IFNγPE、 Ratantimouse IL4PE 0.5 μg室温避光孵育15 min; PBS洗2次， 0.5 mL PBS重悬细胞上机检测(流式细胞仪型号Becton Dickinson， USA)。

　　1．2．3 胞内转录因子FoxP3的流式检测 取1×106细胞， 分别加入Ratantimouse CD4PECy5 (BD Parmigen)， 混匀避光孵育20 min， 用细胞染色缓冲液洗1次， 加1 mL 1×Foxp3 Fix/Perm缓冲液(Biolegend)混匀， 室温避光孵育20 min， 离心弃上清， 1×Foxp3 Perm缓冲液(Biolegend)洗2次， 用1×Foxp3 Perm缓冲液重悬细胞， 室温避光孵育15 min， 离心弃上清， 用1×foxp3 Perm缓冲液重悬， 分成2管， 分别加入5 μL(1 μg) Alexa Fluor 488 Ratantimouse FOXP3、 Alexa Fluor 488 Ratantimouse IgG（作为对照抗体）(Biolegend)室温避光孵育30 min， 用细胞染色缓冲液洗2次， 用0.5 mL细胞染色缓冲液重悬细胞上机分析。

　　1．2．4 统计学分析 所有数据采用SPSS13.0统计软件分析， 各组检测结果均以x±s表示， 先进行方差齐性检验， 方差齐者各组样本均数间的比较采用LSDt检验， P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2．1 脾细胞胞内IFNγ的检测 BCG组、 重组BCG组Th1、 Tc1及总IFNγ明显高于对照组（P&<0.05或P&<0.01， 表1）， 差异具有统计学意义; 但二组间比较没有区别， 差异无统计学意义(P&>0.05)， 表明BCG和重组BCG于新生期接种皆能诱导Th1、 Tc1亚群发育。

　　表1 各组胞内IFNγ检测分析（略）

　　Tab 1 Analysis of intracellular IFNγ among all groups

　　aP&<0.05， bP&<0.01 vs control group.

　　2.2 脾细胞胞内IL4的检测 各组Th3、 Tc2及总IL4水平之间差异无统计学意义（P&>0.05， 表2）。

　　表2 各组胞内IL4检测分析（略）

　　Tab 2 Analysis of intracellular IL4 among all groups

　　2.3 Th1/Th3、 Tc1/Tc2及IFNγ/IL４比值 BCG组、 rBCG组Th1/Th3、 Tc1/Tc2及总IFNγ/IL４比值明显高于对照组（表3）。

　　表3 各组Th1/Th3、 Tc1/Tc2及IFNγ/IL４比值变化（略）

　　Tab 3 Changes of the ratio of Th1/Th3、 Tc1/Tc2、 total IFNγ/IL４ among all groups

　　aP&<0.05， bP&<0.01 vs control group.

　　2．4 CD4+FoxP3+ T细胞在小鼠脾细胞中的表达 对照组、 BCG组及rBCG组脾细胞中CD4+FoxP3+T细胞数分别为（8.3±2.4）%、 （9.2±3.2）%和（9.7±3.4）%， 各组间比较无统计学差异（P&>0.05）。

　　3 讨论
　　
　　BCG通过能诱导Th1免疫应答而防止哮喘的发生［4， 5］， 但对人类哮喘的预防作用存在争议［6］。我们前期研究发现， 新生期皮下接种BCG后不仅能促进Th1免疫功能成熟的作用， 而且能通过诱导Tr1发挥抗哮喘作用［1］; 早期接种BCG能抑制致敏原诱发的嗜酸性粒细胞炎症、 支气管周围炎症和气道高反应性; 但作为诱发或加重小儿哮喘最常见的危险因素之一RSV能逆转新生期BCG接种的抗哮喘作用［2］， 其机制尚不清楚。如何增强BCG诱导Th1/Tr作用， 使其能有效抵抗RSV干扰、 预防哮喘发生， 值得进一步的研究。
　　
　　IL12主要由DC和巨噬细胞产生， 能够促进Th1分化发育， 诱导CD4+/CD8+T细胞、 NK细胞、 NKT细胞等产生IFNγ， 是衔接天然免疫和特异性免疫的关键细胞因子。皮下注射重组IL12能减少哮喘患者嗜酸性粒细胞水平， 但降低气道高反应性的作用不明显， 也不能改善随后的哮喘症状， 并有严重的副作用［3］。但IL12重组乳酸菌却能明显的逆转哮喘小鼠Th1/Th3失衡， 降低气道高反应性， 减轻气道炎症［7， 8］。提示将IL12与某些细菌载体重组， 使其在免疫应答的局部产生免疫调节作用且可避免其副作用。由此， 我们将IL12与BCG重组以避免直接使用重组IL12的副作用又能增强BCG的Th1/Tr应答。
　　
　　本研究中我们在单细胞水平分析了rBCG新生期接种对小鼠脾脏T细胞亚群的影响， 结果表明小鼠新生期接种BCG和rBCG均能引起明显的Th1、 Tc1细胞比例增加， 表现为CD3+CD8-IFNγ+、 CD3+CD8+IFNγ+ T细胞比例的增加， 说明新生期接种BCG和rBCG均能促进小鼠Th1、 Tc1细胞亚群的发育。
　　
　　调节性T细胞包括CD4+CD25+调节性T细胞、 以分泌高水平IL10为特征的Tr1和以分泌高水平TGFβ为特征的Th3细胞， 其中FoxP3是CD4+CD25+调节性T细胞发育和功能中关键转录因子， CD4+FoxP3+细胞可以代表绝大多数具有调节/抑制功能的T淋巴细胞［9］。与我们以前的结果相似［10］， 本研究结果表明新生期接种BCG和rBCG并不能诱导脾脏产生更多的CD4+FoxP3+的调节性T细胞亚群。由于没有对CD4+FoxP3+T细胞的功能进行深入的研究， 并不排出新生期接种BCG后其功能有所变化。
　　
　　但 BCG和rBCG组各个指标没有明显差异， 重组后的rBCG并没有达到预期效果。我们考虑与以下因素有关: 一是与IL12重组质粒在体内分泌IL12不足， 不足以影响机体整体免疫应答， 二是目前检测手段还不能区别二组差异。还需进一步研究rBCG在体内的功能。
　　
　　综上所述， 新生期接种rBCG能促进小鼠脾脏Th1、 Tc1细胞亚群的发育， 提示在婴幼儿早期阶段接种rBCG能促进个体免疫系统的成熟， 向Th1、 Tc1方向发育， 为在婴幼儿早期阶段应用rBCG来预防变态反应性疾病的发生提供一定的理论基础。

参考文献

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　　［2］ Li R， Yang X， Wang L， et al. Respiratory syncytial virus infection reversed antiasthma effect of neonatal Bacillus CalmetteGuerin vaccination in BALB/c mice［J］. Pediatr Res， 2006， 59(2): 210-215.

　　［3］ Bryan SA， O’Connor BJ， Matti S， et al. Effects of recombinant human interleukin12 on eosinophils， airway hyperresponsiveness， and the late asthmatic response［J］. Lancet， 2000， 356(9248): 2149-2153.

　　［4］ Smit JJ， Folkerts G， Nijkamp FP. Mycobacteria， genes and the ‘hygiene hypothesis’［J］. Curr Opin Allergy Clin Immunol， 2004， 4(1): 57-62.

　　［5］ Barlan I， Bahceciler NN， Akdis M， et al. Bacillus CalmetteGuerin， Mycobacterium bovis， as an immunomodulator in atopic diseases［J］. Immunol Allergy Clin North Am， 2006， 26(2): 365-377.

　　［6］ Omar MT， Ahmed SH， Sarkis NN. A study of the association between delayed type hypersensitivity reaction to mycobacterium tuberculosis and atopy in asthmatic children［J］. J Egypt Public Health Assoc， 2005， 80(3-4): 463-474.

　　［7］ Wu C， Yang G， BermudezHumaran LG， et al. Immunomodulatory effects of IL12 secreted by Lactococcus lactis on Th1/Th3 balance in ovalbumin (OVA)induced asthma model mice［J］. Int Immunopharmacol， 2006， 6(4): 610-615.

　　［8］ BermudezHumaran LG， CortesPerez NG， AhLeung S， et al. Current prophylactic and therapeutic uses of a recombinant Lactococcus lactis strain secreting biologically active interleukin12［J］. J Mol Microbiol Biotechnol， 2008， 14(1-3): 80-89.

　　［9］ Campbell DJ， Ziegler SF. FOXP3 modifies the phenotypic and functional properties of regulatory T cells［J］. Nat Rev Immunol， 2007， 7(4): 305-310.

　　［10］ 李 睿， 刘恩梅， 杨锡强， 等. 新生期小鼠卡介苗接种对脾脏T细胞功能亚群发育的影响［J］. 中华儿科杂志， 2005， 43(2): 124-127.