IL1受体拮抗剂对大鼠肝星状细胞Ⅰ、 Ⅲ型胶原及TIMP1 mRNA表达的影响

　　　　 作者：邓存良， 黄捷， 陈文， 王明勇， 陈枫

【摘要】 　　目的: 研究白细胞介素1受体拮抗剂（IL1ra）对大鼠肝星状细胞（HSC）Ⅰ型胶原（ColⅠ）、 Ⅲ型胶原（ColⅢ）和基质金属蛋白酶组织抑制因子1（TIMP1）基因表达的影响， 探讨IL1ra抗肝纤维化作用的机制。方法: 原位分离、 培养大鼠HSC， 荧光显微镜观察及免疫细胞化学染色法鉴定。用1 μg/L、 10 μg/L、 100 μg/L3个浓度的IL1ra分别作用于HSC 48 h， 实时荧光定量RTPCR法检测ColⅠ、 ColⅢ和TIMP1 mRNA的表达。结果: 对照组ColⅠ、 ColⅢ和TIMP1 mRNA的表达水平分别为1.97±0.29、 2.70±0.57、 3.83±0.30。加入1 μg/L、 10 μg/L、 100 μg/L IL1ra后ColⅠ 基因表达水平依次为1.34±0.35、 0.86±0.19、 0.35±0.03; ColⅢ基因表达水平依次为2.02±0.29、 1.13±0.09、 0.47±0.11; TIMP1 mRNA的表达水平依次为3.12±0.25、 2.53±0.38、 1.98±0.18， 与对照组比较， 不同浓度处理组ColⅠ、 ColⅢ和TIMP1 mRNA的表达均明显降低（P&<0.05）。结论: IL1ra以剂量依赖方式抑制HSC中ColⅠ、 ColⅢ及TIMP1 mRNA的表达， 具有抗纤维化作用。

【关键词】 肝星状细胞 白细胞介素 1受体拮抗剂 Ⅰ型胶原 Ⅲ型胶原 基质金属蛋白酶组织抑制因子 1

　　肝纤维化是所有慢性肝病共有的病理改变。IL1是纤维化形成过程中重要的细胞因子。可以活化肝星状细胞（hepatic stellar cell， HSC）， 进而促进其分泌Ⅰ、 Ⅲ、 Ⅳ型胶原、 层黏连蛋白等多种细胞外基质成分及基质金属蛋白酶组织抑制因子 (tissue inhibitor of metalloproteinases， TIMPs)， 从而促进肝纤维化的发生发展。我们的前期工作表明白细胞介素1受体拮抗剂（interleukin Ⅰ receptor antagonist， IL1ra）可抑制肝纤维化大鼠星状细胞的增殖和胶原的合成， 减少肝脏细胞外基质的沉积［1］。有研究发现IL1β受体拮抗剂可降低TIMP1 mRNA的表达［2］。本试验的目的是系统观察IL1ra对HSC表达Ⅰ型胶原（CollagenⅠ， ColⅠ）、 Ⅲ型胶原（CollagenⅢ， ColⅢ）和TIMP1基因的影响， 探讨IL1ra抗肝纤维化作用的机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 Wistar雄性大鼠(质量450～500 g)， 购自第三军医大学西南医院实验动物科。IL1ra 由北京大学医学部马大龙教授惠赠; 鼠抗人结蛋白（desmin）单克隆抗体（mAb）购自DAKO公司; 实时荧光检测试剂盒购自美国BioRad公司; PCR引物由上海生物工程公司合成部合成; 总RNA提取试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司; RTPCR试剂盒购自TaKaRa（日本）公司; Realtime PCR仪、 Doc2000型凝胶成像系统购自美国BioRad公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 大鼠HSC的分离、 培养及鉴定 参照翁山耕等［3］的方法。Wistar大鼠禁食禁水12 h， 20 g/L戊巴比妥钠腹腔麻醉， 切开腹腔， 用留置针头穿刺门静脉。37℃预灌注液以10 mL/min 的速率灌注约10 min， 当整个肝脏变成黄色时， 换用37℃含Ⅳ型胶原酶溶液灌注至整个肝脏几乎呈液状。将肝脏从大鼠腹腔中切除， 去除肝包膜及结缔组织， 剪碎肝组织， 倒入一预装有50 mL振荡消化液烧瓶， 再加入含0.6 g/L CaCl2的DHank’s液至100 mL， 37℃振荡消化30 min， 所得细胞悬液依次经150目、 200目金属网过滤， 滤液收集于离心管。500 g离心7 min， 弃上清。每管加入40 mL RPMI1640培养液， 反复吹打， 使细胞充分混匀。50 g离心2 min（20℃）， 反复2次， 弃沉淀。上清液500 g离心7 min（20℃）， 弃上清， 沉淀用RPMI1640培养液500 g离心冲洗2次。加入RPMI1640液12 mL、 330 g/L Nycodenz 液各6 mL， 充分混匀， 将细胞悬液分装入10 mL离心管。在细胞悬液上小心滴加一层RPMI1640培养液， 1500 g离心15 min（20℃）。将RPMI1640液与细胞悬液交界面间的细胞吸出， 用RPMI1640液500 g离心7 min（20℃）， 冲洗2次。然后将细胞悬浮于含200 mL/L胎牛血清RPMI1640培养液中， 移至细胞培养瓶， 置37℃ 50 mL/L CO2培养。2～3 d传代1次。用荧光显微镜观察新鲜分离的HSC， HSC在波长为328 nm荧光显微镜下有蓝绿色自发荧光。用免疫细胞化学染色法（SABC法）鉴定分离细胞的Desmin表达: 将盖玻片放入装有细胞悬液的培养皿中， 待细胞贴壁伸展后， 取出盖玻片， 自然干燥; 30 mL/L h3O2去离子水孵育5～10 min， 双蒸水冲洗， PBS浸泡5 min; 滴加一抗（鼠抗人desmin mAb， 稀释度1∶100）， 阴性对照以0.01 mol/L PBS代替一抗， 湿盒37℃恒温孵育2 h; PBS液清洗2 min×3次， 滴加生物素化二抗， 湿盒37℃恒温孵育20 min; PBS清洗5 min×3次， DAB显色， 室温镜下控制反应时间， 双蒸水终止反应。苏木素液轻度复染， 二甲苯透明， 中性树胶封片。显微镜下照相。

　　1.2.2 实验分组及处理 HSC细胞 1×106接种于100 mL/L胎牛血清的培养皿中， 常规培养24 h后换含终浓度为用1 μg/L、 10 μg/L、 100 μg/L3个浓度的IL1ra的无血清RPMI1640 培养液， 6 h后加入胎牛血清使成为100 mL/L胎牛血清， RPMI1640培养液继续培养， 作用48 h。对照组为不含ILra的培养液。每组4孔细胞。

　　1.2.3 Ⅰ、 Ⅲ胶原、 TIMP1 mRNA表达的检测 按试剂盒说明书提取细胞的总RNA。取逆转录产物cDNA模板3 μL， 分别加入含有荧光染料50 μL的反应体系中， 行实时荧光定量PCR。将实时荧光PCR仪检测荧光强度的时相统一设定在扩增反应的退火期， 本实验采用55℃ 30 s作为退火期。30个循环的扩增反应结束后， 系统将采集到的每一循环反应时的各反应管的荧光强度增长指数进行分析， 绘制每一反应管的扩增动力学曲线。根据动力学曲线计算出各组mRNA表达量（表1）。

　　表1 各引物序列、 扩增长度及位点（略）

　　1.2.4 统计学处理 数据以x±s表示， 组间比较进行单因素方差分析， 检验水准为双测α=0.05。采用SPSS13.0统计软件进行数据处理。

　　2 结果

　　2.1 大鼠HSCs的分离 分离的细胞经生长期形态学观察及免疫组织化学方法染色， 可见所分离的细胞表达desmin（图1）。证实确为大鼠的HSCs。

　　图1 免疫组织化学染色显示HSC表达desmin (×200)（略）

　　2.2 IL1ra对COLⅠ、 COLⅢ及TIMP1 mRNA表达的影响 与空白对照组比较， IL1ra以剂量依赖方式抑制大鼠HSC COLⅠ、 COLⅢ、 TIMP1的mRNA的表达（P&<0.05， 表2）。

　　表2 COLⅠ、 COLⅢ及TIMP1 mRNA的表达（略）

　　aP&<0.05 vs 对照组.

　　3 讨论
　　
　　肝纤维化的共同特点是以胶原蛋白为主的细胞外基质(ECM)成分合成增多， 降解不足。目前学者们普遍认为多种细胞因子激活HSC是肝纤维化形成和发展的中心环节。激活后的HSC分泌Ⅰ、 Ⅲ、 Ⅳ型胶原、 层黏连蛋白、 纤维连接蛋白、 透明质酸等多种ECM成分; 合成和分泌金属蛋白酶组织抑制因子（TIMPs）增加; 抑制基质金属蛋白酶（MMPs）对ECM的降解， 从而促进肝纤维化的形成。ILl是激活HSC的重要细胞因子， 半数以上肝纤维化患者血清中IL1的水平升高。在不同的肝纤维化动物模型中的早期炎症阶段， IL1在肝脏的基因表达即增加。Tiggelman等［4］发现体外IL1作用于人HSC能促进其胶原合成， 加强转化生长因子β（TGFβ）的合成与释放， 诱导黏附因子及其受体表达。IL1还可通过促进TIMP的产生抑制ECM的降解［5］。
　　
　　IL1ra是IL1的特异性抑制剂。IL1ra的氨基酸序列与IL1α有26%同源性、 与IL1β有19%同源性。因为缺乏与IL1受体辅助蛋白(IL1RAcp)结合的区域， IL1ra与IL1R结合不产生效应。故其能竞争性地结合IL1r， 特异性地抑制细胞表面IL1R与IL1结合， 从而阻断IL1的生物活性［6］。我们的前期研究表明IL1ra能改善肝纤维化大鼠的血清生化指标， 大鼠血清转氨酶水平， Ⅲ型前胶原、 Ⅳ型胶原、 透明质酸和层黏连蛋白含量均明显降低， 病理检查示肝内Ⅰ、 Ⅲ型胶原含量亦明显下降［1］。本研究显示， IL1ra能以剂量依赖方式抑制HSC表达Ⅰ、 Ⅲ型胶原及TIMP1 mRNA。说明lL1ra具有抑制肝细胞炎症、 抗肝纤维化形成和改善肝的组织学变化等作用。IL1ra抗肝纤维化的作用应与其对IL1生物活性的影响有关。IL1ra一方面抑制IL1与T细胞结合， 阻断其刺激活化T细胞产生大量细胞因子， 从而抑制HSC的活化。另一方面IL1ra直接抑制IL1与HSC结合， 阻断其活化HSC及刺激HSC分泌ECM及TIMPs等肝纤维化相关物质［7］。本研究结果表明IL1ra在抑制肝纤维化的发生发展过程中可能起重要的作用。有必要对其具体作用机制进一步研究。

参考文献

　　［1］ 邓存良， 陈国民， 余光开， 等. 重组人白细胞介素1受体拮抗剂抗纤维化的实验研究［J］. 中华微生物学和免疫学杂志， 2000， 20(2): 140-141.

　　［2］ Roderfeld M， Geier A， Dietrich CG， et al. Cytokine blockade inhibits hepatic tissue inhibitor of metalloproteinase1 expression and upregulates matrix metalloproteinase9 in toxic liver injury［J］. Liver Int， 2006， 26(5): 579-586.

　　［3］ 翁山耕， 冷西圣， 魏玉华， 等. 改良法大鼠肝星状细胞的分离培养及鉴定［J］. 北京大学学报， 2001， 33(1): 83-86.

　　［4］ Tiggelman AM， Boers W， Lintborst C， et al. Collagen synthesis by human liver(myo) fibroblasts in culture: evidence for a regulatory role of IL1β， IL4， TGFβ and IFNγ［J］. Hepatol， 1995， 23(3): 301-317.

　　［5］ Zhang YP， Yao XX， Zhao X. Interleukin1β upregulates tissue inhibitor of matrix metalloproteinase1 mRNA and phosphorylation of cjun Nterminal kinase and p38 in hepatic stellate cells［J］. World J Gastroenterol， 2006， 12(9): 1392-1396.

　　［6］ Arend WP. The balance between IL1 and IL1ra in disease［J］. Cytokine Growth Factor Rev， 2002， 13(4-5): 323-340.

　　［7］ Yuan PH， Ling Z， Jian HW， et al. Essential role of matrix metalloproteinase in interleukin1 induced myfibroblastic activation of hepatic stellate cell in collagen［J］. J Biol Chem， 2004， 279(6): 4820-4828.