抗PTDbcr/abl单克隆抗体的制备及鉴定

【摘要】 目的: 制备单克隆抗体（mAb）并初步用于PTDbcr/abl融合蛋白的研究， 为慢性粒细胞白血病的免疫治疗提供实验依据。方法: 在大肠杆菌中表达PTDbcr/abl融合蛋白， 用所获得的蛋白免疫BALB/c小鼠， 常规收集小鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合， 筛选杂交瘤细胞株的阳性克隆， 并对其进行一系列鉴定。结果: （1）表达PTDbcr/abl融合蛋白; （2）制备了抗PTDbcr/abl融合蛋白mAb; （3）用mAb以多种方法检测PTDbcr/abl融合蛋白， 证实此抗体效价高， 特异性强。结论: 此抗体可用于PTDbcr/abl融合蛋白的进一步研究。

【关键词】 PTDbcr abl融合蛋白 单克隆抗体 制备

　　PTDbcr/abl是一种利用基因工程合成的融合蛋白［1， 2］。其中PTD（蛋白转导结构域）是人类免疫缺陷病毒（HIV）1所编码的反式激活蛋白TAT的一段多肽片段， 具有独特的跨膜转运方式， 其特点是转导速度快， 效率高。Schwarze等［3］发现将PTD融合于相对分子质量(Mr)为15×103～2×105的蛋白时， 可介导这些蛋白从细胞外向细胞内直接跨膜转运。Bcr/Abl是慢性粒细胞白血病（CML）细胞中特异的bcr/abl融合基因所编码的融合蛋白， 其Mr为21×104， 具有异常的酪氨酸激酶活性。我们以前已利用基因重组方法构建了PTDbcr/abl的原核表达质粒， 并在大肠杆菌中获得表达。而且证实表达产物PTDbcr/abl融合蛋白与K562或HL60细胞共同孵育后， 可进入细胞内［1］。我们用纯化的PTDbcr/abl融合蛋白抗原免疫BALB/c小鼠， 常规收集小鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合， 筛选杂交瘤细胞株的阳性克隆。经ELISA、 Western blot及免
疫组化方法检验， 证实mAb特异性强， 效价高， 可用于PTDcr/abl融合蛋白的进一步研究。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　大肠杆菌BL21购自Navagene公司。表达PTDbcr/abl融合蛋白的质粒pET16bPTDbcr/abl、 HL60、 K562细胞株由本室构建保存; BALB/c小鼠由第四军医大学实验动物中心提供; 免疫组化试剂盒(链亲和素抗生物素蛋白过氧化酶免疫组化超敏试剂盒)购自迈新公司; 小鼠IgG亚类快速定性试纸购于法国Argen公司; HRP标记山羊抗小鼠IgG抗体(由华美生物提供); 免疫球蛋白标准亚类试剂购自Sigma公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 PTDbcr/abl融合蛋白的表达与纯化

　　质粒pET16bPTD与质粒pET16bPTDbcr/abl的制备按照文献［1］进行。用pET16bPTDbcr/abl转化大肠杆菌BL21， 取阳性克隆培养扩增， 用IPTG进行诱导表达后收集菌体， PBS悬浮， 超声裂菌， 并用8 mol/L脲溶解蛋白， 用8mol/L脲（pH值分别是8.0、 6.3、 5.9、 4.5）在NiNTAagarose柱上对蛋白进行亲和层析。收集pH为4.5及5.9的洗脱液， 用4 mol/L脲、 2mol/L脲、 1×PBS/1 mol/L NaCl、 1×PBS/0.5 mol/L NaCl、 1×PBS进行透析后冻干。从中取10 mg干粉溶于2 mL三蒸水中， 取20 μL， 加入
20 μL loading buffer， 100℃煮沸10 min， 进行120 g/L SDSPAGE电泳， 成为蛋白胶。

　　1.2.2 小鼠免疫

　　按

参考文献

［4］进行。取蛋白胶（含蛋白1‰） 40 mg与125 μL完全福氏佐剂， 125 μL PBS充分研磨后， 背部皮下多点注
射免疫BALB/c 小鼠。2周后用蛋白胶（含蛋白1‰） 40 mg与125 μL不完全福氏佐剂， 125 μL PBS充分研磨后， 皮下多点注射， 连续3次， 每次间隔2周， 第3次免疫后14 d， 用PTDbcr/abl 纯化蛋白50 μg/500 μL小鼠腹腔注射， 加强免疫1次， 3 d后取小鼠脾脏待用。

　　1.2.3 细胞融合

　　取免疫小鼠脾细胞与Sp2/0细胞按10∶1的比例， 在500 g/L(W/V)PEG 4000介导下融合， 融合细胞用HAT培养基做选择性培养，
37℃、 50 mL/L CO2孵箱培养， 7 d后改用HT培养基培养。

　　1.2.4 阳性克隆筛选及克隆化培养

　　采用间接ELISA法做交叉筛选。将PTDbcr/abl融合蛋白和HisTaxreb107(另一带有His标签的蛋白， 文章另发)(对照孔)稀释为10 mg/L， 包被96孔酶标板， 100 μL/每孔， 4℃包被过夜， 次日用10 g/L BSA 120 μL/孔封闭后， 分别取待测杂交瘤上清液100 μL加入PTDbcr/abl融合蛋白和HisTaxreb107包被板中， 4℃过夜; 用PBSTween20洗板5次， 加HRP羊抗鼠IgG(1∶1000稀释)
100 μL/孔， 37℃、 1 h; PBSTween20洗板5次， TMB显色; 2 mol/L h3SO4终止反应。置酶标仪450 nm波长测量A值， A450值大于阴性对照孔2.1倍以上为阳性， 选取PTDbcr/abl融合蛋白阳性而HisTaxreb107阴性的孔细胞， 采用有限稀释法进行亚克隆， 至所有杂交瘤上清液均呈阳性为建株标准。

　　1.2.5 mAb的制备及纯化

　　每只BALB/c小鼠腹腔内注入0.5 mL液体石蜡， 1周后将阳性杂交瘤细胞注入小鼠腹腔内， 5×106杂交瘤细胞/只。大约7～10 d后收集腹水， 按常规经饱和硫酸铵盐析、 ProteinG亲和层析进行纯化。用紫外分光光度法测定其浓度， 加入终浓度为0.1 g/L叠氮
钠防腐， 直接分装， -20℃保存。

　　1.2.6 mAb的效价测定

　　以PTDbcr/abl融合蛋白为包被抗原， 包板方法同上， 将纯化抗体作4倍比稀释， 按ELISA法常规测定其A450值， 以测定孔A450值≥阴性孔A450值2.1倍为阳性， 计算其效价。

　　1.2.7 mAb亚类鉴定

　　取纯化腹水， 采用双向琼脂扩散方法进行亚类鉴定， 观察沉淀线的形成。

　　1.2.8 mAb识别PTDbcr/abl融合蛋白的特异性鉴定(Western blot)

　　由于PTDbcr/abl融合蛋白带有His标签， 而His标签的抗原性又较强， 为了了解mAb的主要反应位点是His标签抑或PTDbcr/abl， 我们采用另一带有His标签的蛋白HisTaxreb107作对照进行检验， 取PTDbcr/abl融合蛋白、 K562细胞裂解物样品和HisTaxreb107蛋白， 样品经SDSPAGE电泳后， 转至硝酸纤维膜， 置于1∶400鼠血清稀释液中过夜， PBST洗3次， 加入羊抗鼠（辣根过氧化物酶标记）二抗， 37℃ 2 h后用ABC法显色。

　　1.2.9 细胞免疫组织化学染色检测

　　制备含PTDbcr/abl融合蛋白的HL60、 K562细胞方法见

参考文献

［1］。取细胞HL60、 K562及含PTDbcr/abl融合蛋白的HL60、 K562各5×105甩至用APES处理过的玻片， 依次用过氧化物酶阻断液， 1/500 mAb， 生物素标记的羊抗鼠抗体， 链亲合素-过氧化物酶相作用， 加入显色液， 镜下显色10 min。

　　2 结果

　　2.1 PTDbcr/abl融合蛋白的诱导表达及纯化

　　用pET16bbcr/abl表达质粒转化大肠杆菌BL21， 培养后用IPTG进行诱导， SDSPAGE分析表明， 用pET16bbcr/abl转化的BL21与未转化的BL21裂解产物相比， 在Mr为23×103处有一新生蛋白带， 与预期的融合蛋白大小相同（图1）。

　　2.2 杂交瘤细胞株的建立

　　本次实验融合细胞接种3个96孔细胞培养板，融合率为90.6%， 初选阳性孔14孔， 阳性率为5.4%， 经反复筛选和克隆化， 最终得到3株仅与PTDbcr/abl融合蛋白反应而与HisTaxreb107不发生反应的杂交瘤细胞株， 分别命名为1C9、 2E3、 3E2。经冻存、 复
苏后仍稳定分泌抗PTDbcr/ab mAb。

　　2.3 mAb的亚类鉴定

　　免疫双扩散检测mAb亚类， 3株mAb均为IgG 。

　　2.4 抗PTD

　　bcr/abl mAb的效价 3株mAb均稀释至能与PTDbcr/abl免疫原发生特异性反应且A450值≥ 阴性孔A450值2.1倍， 3种mAb效价分别是1C9 1∶12800、 2E3 1∶12800、 3E2 1∶9600， 说明抗PTDbcr/abl mAb具有高度活性。

　　2.5 抗PTDbcr/abl mAb识别抗原的的特性研究

　　Western blot结果显示3株mAb均能与纯化的PTDbcr/abl融合蛋白及K62细胞中的天然bcr/abl融合蛋白发生特异性反应， 而与HisTaxreb107无反应。表明抗PTDbcr/abl mAb主要识别bcr/abl抗原。

　　2.6 bcr/abl在K562细胞中表达的检测

　　以抗PTDbcr/abl mAb为一抗， 对K562、 含PTDbcr/abl融合蛋白的HL60进行免疫细胞化学染色的结果显示， 在2种细胞中呈现强阳性反应， 说明所制备的mAb具有较强的生物活性及结合能力， 且具有高度特异性。

　　3 讨论

　　肿瘤的免疫治疗， 尤其是细胞免疫治疗， 是以肿瘤的抗原提呈为前提。慢性粒细胞白血病的bcr/abl基因所编码的蛋白主要存在于细胞内， 但其多肽片段可以被人MHC抗原提呈到细胞表面［5， 6］， 此为进行慢性粒细胞白血病的细胞免疫治疗提供了理论依据。
　　PTD具有独特的蛋白转导作用， 将PTD与bcr/abl相连， 旨在提高bcr/abl的提呈效率以期引起细胞免疫反应。我们以前的实验已经证明PTD可以有效地转导bcr/abl进入细胞内［1］。在本实验中， 我们成功制备了针对PTDbcr/abl融合蛋白的mAb。免疫组化亦证实此mAb可有效地与细胞内PTDbcr/abl相作用。为了纯化PTDbcr/abl而引入His标签， 经Western blot检验证实抗PTDbcr/abl融合蛋白mAb的主要识别的是bcr/abl而非His标签， 表明此抗体仅特异识别目的蛋白。我们所建立的杂交瘤细胞株经过反复冻存复苏后仍然长势良好， 连续多次传代后仍能稳定分泌抗PTDbcr/abl融合蛋白mAb。此研究不仅为进一步研究PTDbcr/abl融合蛋白的提供了有效的工具， 而且为进一步研究针对bcr/abl融合蛋白的细胞内抗体提供依据。

参考文献

　　［1］梁英民， 孙 强， 蒋姗姗， 等. PTDbcr/abl融合癌蛋白片段的表达及其跨膜转运［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2001， 17(4): 377-380.

　　［2］梁英民， 孙 强， 蒋姗姗， 等. 蛋白转导结构域bcr/abl融合基因的构建和表达［J］. 中华血液学杂志， 2002， 23(1): 5-8.

　　［3］Schwarze SR， Ho A， VoceroAkbani A， et al. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse［J］. Science， 1999， 285(5433): 1569-1572.

　　［4］Tadjine M， Mittal KR， Bourdon S， et al. Production and characterization of murine monoclonal antibodies against Haemophilus parasuis and study of their protective role in mice［J］. Microbiology， 2004， 150(12): 3935-3945.

　　［5］Nieda M， Nicol A， Kikuchi A， et al. Dendritic cells stimulate the expansion of bcrabl specific CD8+ T cells with cytotoxic activity against leukemic cells from patients with chronic myeloid leukemia［J］. Blood， 1998， 91(3): 977-983.

　　［6］Yotnda P， Firat H， GarciaPoons F， et al. Cytotoxic T cell response against the chimeric p210 BCRABL protein in patients with chronic myelogenous leukemia［J］. J Clin Invest， 1998， 101(10): 2290-2296.·论著·