BrdU标记在大鼠睾丸支持细胞体外培养中的应用

【摘要】 目的: 探讨大鼠睾丸支持细胞原代培养5溴2脱氧尿苷（BrdU）的最佳标记时间、 剂量。方法: 大鼠睾丸支持细胞进行体外原代培养; 以终浓度分别为5、 10、 15、 20 μmol/L的BrdU检测睾丸支持细胞的最佳标记剂量; 在细胞培养的12、 24、 36、 48 h掺入BrdU， 使终浓度为15 μmol/L， 测定BrdU的最佳标记时间; 免疫细胞化学法跟踪观察大鼠睾丸支持细胞在体外培养中的分化
发育情况和BrdU标记率。结果: 免疫组化检查提示最终浓度为15 μmol/L和孵育36 h BrdU标记率均&>90%， 并且连续传3代均可检测到。结论: 终浓度15 μmol/L及孵育36 h为BrdU标记睾丸支持细胞的最佳剂量及时间， 表明BrdU 标记可用于睾丸支持细胞体内后的存活、 生长的动态观
察。

【关键词】 睾丸支持细胞 体外培养 BrdU

　　5溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记法作为一种简便、 敏感、 特异的检测方法， 在医学的各个领域都有广泛的应用。BrdU掺入合成的强度可直接显示细胞增殖的能力， 同时能避免以往应用3HTdR检测对细胞的放射性损害[1]。睾丸支持细胞缺乏有效的标记方法， 因此本实验的目的是应用BrdU体外标记原代大鼠睾丸支持细胞（sertoli cell）， 观察最佳标记时间及标记量， 从而为追踪BrdU标记的睾丸支持细胞移植入体内后的存活、 生长及分化的动态变化过程打下基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　SD雄性大鼠（体质量约100 g， 17～22 日龄）购于第四军医大学动物试验中心; DMEMF12培养基、 优质胎牛血清购自Gibco公司， 胶原酶、 胰酶、 BrdU购自Sigma公司; 抗 BrdU抗体及SABC试剂盒均购自武汉博士德公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 大鼠睾丸支持细胞体外分离培养

　　取大鼠睾丸， 剥除被膜， 收集睾丸实质于50 mL离心管中， 4℃ 900 r/min离心4 min， 倾去上清。按每克睾丸组织加8 mL 2.5 g/L胰蛋白酶， 32℃ 210 r/min振荡、 消化30 min。加入培养液终止消化， 待组织沉降后， 弃去上清。重复此步骤3次。再以每克睾丸组织加6 mL1 g/L Ⅰ型胶原酶， 34℃ 210 r/min振荡， 消化30 min。用100目钢筛过虑收集细胞， 900 r/min离心10 min， 收
集细胞， 用含100 mL/L胎牛血清的培养液洗3次（900 r/min， 3 min）， 稀释细胞至1.5×109/L， 接种于25 cm2塑料培养瓶。34℃、 CO2培养箱中50 mL/LCO2培养48 h， 于倒置显微镜下观察细胞贴壁情况（图1）， 吸去培养液后加入20 mmol/L， pH7.4的TrisHCl缓冲液低渗处理3 min后， 用培养液洗涤2次， 洗去大部分生精细胞。加入含100 mL/L胎牛血清的DMEMF12培养液继续培养， 逐日更换培养液并进行观察。

　　1.2.2 传代后大鼠睾丸支持细胞的鉴定

　　将培养的支持细胞用2.5 g/L胰酶消化并洗涤后， 接种到1个6孔板中， 并在6孔板中各孔加入1块经多聚赖氨酸包被的盖玻片， 将细胞放入培养箱中继续培养， 待细胞生长于载玻片后， 将载玻片取出， 在Carnoy中固定12 min。950 mL/L、 700 mL/L乙醇、 蒸馏水及盐酸分步漂洗; 置于60℃的1 mmol/L HCl 12 min后在冷盐酸中漂洗; chiff试剂内2 h; 入100 mL/L偏重亚硫酸钠溶液除去非特异染色后， 经自来水、 蒸馏水、 700 mL/L、 950 mL/L及1000 mL/L乙醇分步洗涤， 固绿染色; 显微镜下观察并摄片（图1）。收集培养6～8 d的支持细胞， 在25 g/L戊二醛固定液中预固定， 经锇酸后固定、 脱水、 包埋、 半薄切片定位、 超薄切片等步骤后， 在JEOL JEM1220透射电子显微镜下观察其超微结构。

　　1.2.3 BrdU标记方法

　　每日观察细胞生长情况， 绘制大鼠睾丸支持细胞生长曲线。以1×105/L将睾丸支持细胞接种于爬片处理的6孔板中， 并以终浓度分别为5、 10、 15、 20 μmol/L的BrdU检测睾丸支持细胞的最佳标记剂量; 在细胞培养的12、 24、 36、 48 h掺入BrdU， 使终浓度为15 μmol/L， 测定BrdU的最佳标记时间; 设定正常对照组观察BrdU有无细胞毒性。随机数取10个非重叠视野（×100）， 计算BrdU 阳性细胞占总细胞数的比例。

　　1.2.4 BrdU标记免疫组化染色

　　具体步骤如下: （1）PBS清洗标本3 次各1 min; （2）40 g/L多聚甲醛固定30 min， PBS冲洗5 min， 3次; （3
）30 mL/L h3O2于室温封闭内源性过氧化氢酶30 min， PBS冲洗5 min， 3次; （4）2N HCl于室温下变性30～45 min， 使其双螺旋打开暴露BrdU标记部位。（5）1∶20正常山羊血清封闭20 min， 甩去多余的液体不洗; （6）抗BrdU 一抗（1∶30） 4℃湿盒中过夜、 PBS冲洗5 min， 3次; （7）山羊抗小鼠cy3孵育45 min， PBS漂洗3次， 每次3 min; （8）DAPI复染， 荧光倒置显微镜观察（图1）。以上每步间必须用PBS缓冲液充分振洗后方可继续下一步骤。

　　1.2.5 对照试验

　　阳性对照为BrdU标记的睾丸支持细胞， 阴性对照为未经BrdU标记的睾丸支持细胞， 空白对照以PBS替代一抗。

　　1.2.6 统计学处理

　　各组BrdU 标记率的比较采用χ2检验。P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 睾丸支持细胞的传代、 扩增与纯化

　　单个睾丸支持细胞悬液接种于25 cm2塑料培养瓶，支持细胞贴壁性比较强， 培养24 h之后， 大多数细胞开始贴壁， 培养液中漂浮着较多生精细胞。培养48 h之后， 胞质逐渐增多， 折光性减弱。3～4 d后支持细胞胞质铺展， 细胞间隙变小。4～6 d后胞质完全铺开， 细胞相互连接， 铺展成膜状单层。吸去培养液后加入20 mmol/L， pH7.4的TrisHCl缓冲液低渗处理3 min后， 用培养液洗涤2次， 洗去大部分生精细胞。加入含50 mL/L胎牛血清的培养液继续培养， 逐日更换培养液并进行观察。经胰酶消化后1∶2传代， 培养48 h后， 支持细胞胞体进一步增大， 呈膜状铺在培养瓶壁上。细胞核圆形或椭圆形， 居中或稍偏位， 核仁清晰， 胞质中可见较多的颗粒状物质或空泡，
突起进一步增多， 并密集交织在一起(图1)， 仍有少量的生精细胞存在; 随着培养时间的延长， 培养到第3～4天后， 支持细胞融合成片， 折光性减弱。根据Moss等形态学及胞内空泡的检测， 支持细胞约占细胞总量的90%以上。Sertoli细胞在体外培养增殖旺盛， 培养至20 d细胞仍存活良好。

　　2.2 Feulgen染色和透射电镜观察

　　对培养8 d的Sertoli细胞进行Feulgen染色（图1）， 胞质不着色， 核内淡染， 核内有着色的颗粒， 为核仁
周围的卫星核小体。透射电镜下观察细胞质可见很多线粒体、 溶酶体、 脂滴、 糖原颗粒、 滑面内质网、 粗面内质网等。Sertoli细胞的核呈不规则形， 核膜具有较多的皱褶， 核染色质稀疏， 染色浅， 核仁明显， 核仁周围有卫星核小体。国外学者多强调观察到核仁两侧的卫星核小
体， 可确定是支持细胞。Feulgen染色和电镜都观察到了卫星核小体， 证实了确实为Sertoli细胞。

　　2.3 BrdU标记率

　　以不同浓度标记发现， 15 μmol/L的BrdU标记率&>90%， 与20 μmol/L的BrdU无统计学意义（P&>0.05）， 与10 μmol/L(LI约70%)有统计学意义（LI约75%， P&<0.05）。不同孵育时间标记发现， 孵育12 h即可见BrdU阳性染色细胞， 标记率约为12%; 随着标记时间延长阳性细胞数增多， 标记36 h细胞阳率&>90%。但标记时间继续延长标记细胞数目无明显增多， 标记36 h组与48 h组之间的阳性细胞数无统计学意义（图2）。为此， 我们发现选用标记36 h、 终浓度为15 μmol/L作为标记时间， 完全能够满足移植细胞的标记需要， 连续传代3次后仍可见BrdU免疫染色阳性。在相差显微镜下观察细胞的形态、 生长、 增殖与对照组相比无统计学意义。

　　3 讨论

　　睾丸支持细胞是睾丸生精上皮中惟一的非生殖细胞， 对生精细胞起支持和营养作用[2]。近年来研究表明， 支持细胞还能分泌多种物质， 包括转运蛋白， 调节蛋白， 生长因子， 类固醇及其他一些活性物质， 这些物质在精子发生过程中起着重要的调节作用。另外对支持细胞生物特
性的研究还揭示， 支持细胞表达一种特殊的表面分子FasL， 它可以与免疫细胞表面的Fas受体结合， 诱导免疫细胞的凋亡[2]， 故可利用睾丸支持细胞作为各种免疫豁免细胞来源， 可植入体内发挥其免疫豁免作用， 但是体内细胞移植的众多问题之一是如何简便有效的标记移植细胞
并跟踪其在体内的存活、 生长和分化过程[3]。

　　细胞标记的方法有多种方法[4]， 当 BrdU存在于细胞DNA合成期的时候， BrdU就会掺入到新合成的DNA中， 这种存留是永久性的， 经免疫组织化学染色可观察在掺入细胞中的BrdU， 故BrdU标记和检测是反映细胞增殖及跟踪检测移植细胞动态变化的理想指标[3]。研究表明， BrdU标记结合免疫细胞化学技术和 3HTDR放射自显影技术2种方法的结果十分相似[5]。本试验首次采用BrdU标记大鼠睾丸支持细胞， 并用抗BrdU mAb进行免疫细胞化学染色， 研究结果表明使用BrdU进行标记不会影响细胞的生长、 增殖及分化， 故应用BrdU标记细胞较为安全可靠。

　　BrdU标记细胞48 h， 终浓度为15 μmol/L， 时标记率&>90%， 且传代细胞可连续标记， 提示移植细胞可在体内连续追踪观察。为我们进一步追踪睾丸支持细胞植入体内后的生长分化提供了理论指导。
　　
　　通过本试验我们总结BrdU标记大鼠睾丸支持细胞的优点是[6]: （1）简单、 快速、 安全检测敏感性好; （2）BrdU即可用于活体标记， 亦可用于细胞原代培养与鉴定; （3）BrdU标记是一种快速、 简便、 可靠的方法， 并可选择适合的双标记或多标记方法， 同时显示2种以上的
标记物质; （4）短时间内可对批量试验动物的标本同时进行检测; （5）使用BrdU对标记细胞、 活体细胞无毒副作用， 为动态观察移植细胞在动物体内的生存、 生长和分化过程提供了理论依据。

参考文献

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