IL18基因转染对小鼠卵巢癌OVHM体外增殖及体内成瘤的影响

　　　　　　作者：崔澂， 郝淑维， 李新伟， 白小嘉， 程建新， 单保恩

【摘要】 　　目的: 分析转染IL18基因后， 对小鼠卵巢癌OVHM细胞体外增殖、 凋亡及体内成瘤的影响， 初步探讨IL18基因转染治疗卵巢癌的应用价值。方法: 将逆转录病毒携带的小鼠IL18基因成功转染至OVHM（OVHM/IL18）， 以空载体转染的OVHM（OVHM/LXSN）和野生型（OVHM）作为对照。分别采用MTT、 FCM检测体外培养细胞的增殖、 凋亡及周期分布。于裸鼠皮下分别接种细胞， 观察各组种植瘤生长情况， 计算成瘤率; RTPCR检测瘤组织中IL18 mRNA表达; FCM和电镜分析肿瘤细胞增殖、 凋亡状况。结果: 3组细胞的体外增殖未见明显差异， 均无明显凋亡现象， 增殖指数、 细胞周期分布均无明显差异（均P&>0.05）。接种后， 3组裸鼠的成瘤率相同， 但OVHM/IL18组成瘤时间较晚， 随瘤龄增长肿瘤生长缓慢， 瘤组织中IL18 mRNA阳性表达。OVHM/IL18组裸鼠种植瘤细胞可见典型的凋亡现象， G0/G1期细胞明显增多， S期细胞明显减少， 增殖指数明显降低， 凋亡指数明显增高（P&<0.01）。结论: IL18基因成功转染后， 虽对体外卵巢癌细胞无直接毒性， 但可能在体内借助非直接杀伤的其他途径， 通过阻断细胞周期、 促进肿瘤细胞凋亡等抑制体内成瘤。

【关键词】 IL 18 基因转染 OVHM 增殖 凋亡 成瘤

　　［Abstract］ AIM: To investigate the effects of IL18 gene transfection on proliferation， apoptosis and tumorigenesis of mouse ovarian cancer cell line OVHM. METHODS: OVHM were transfected with retrovirus encoding IL18 gene (OVHM/IL18). The wild OVHM and OVHM transfected with vector without IL18 gene (OVHM/LXSN) were enrolled as the controls. The proliferation， cell cycle and apoptosis were measured by MTT and FCM respectively. The nude mice were subcutaneously inoculated with the three different cells respectively. The observation of transplanted tumor’s growth and calculation of tumorigenesis ratio was made. The expression of IL18 mRNA in tumor tissues was detected by RTPCR， and the apoptosis of tumor cell in tissue was analyzed by electron microscope and FCM. RESULTS: The three cells cultured in vitro showed no apoptotic peaks， and no differences in proliferation and cell cycle (All P&>0.05). Following inoculation， the ratios of tumorigenesis were similar in all the three groups. But in OVHM/IL18 group， the latent period of tumorigenesis was longer with slower tumor growth rate and positive expression of IL18 mRNA in tumor tissue. It was also observed that in the tumor cells from nude mice inoculated by OVHM/IL18， the cells in phase of G0/G1 increased with typical morphology of apoptosis， and those in S phase decreased with decreased proliferation index and increased apoptosis index (All P&<0.01). CONCLUSION: Although IL18 gene has no cytotoxic effects in vitro， its inhibiting effects on tumorigenesis of OVHM in vivo were exerted by interdicting cell cycle and accelerating apoptosis of tumor cells.

　　［Keywords］IL18; gene transfection; OVHM; proliferation; apoptosis; tumorigenesis

　　IL18是1995年发现的具有抗瘤作用的重要免疫调节因子［1］; 卵巢癌是妇科常见恶性肿瘤之一， 死亡率位居女性生殖系统肿瘤首位［2］。研究证实，随着卵巢组织从正常向良性及恶性肿瘤的转变， 组织中IL18 mRNA及蛋白表达递减直至缺如［3］。提示， 若将IL18基因导入卵巢癌细胞， 纠正其缺陷表达， 则可能有效诱导IL18的抗瘤效应。因此， 我们研究了IL18基因成功转染至小鼠卵巢癌OVHM细胞后， 对体外肿瘤细胞的直接杀伤及体内成瘤的影响， 初步探讨将IL18基因作为优选靶对卵巢癌进行基因治疗的可行性。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 OVHM由日本大阪大学医学院Hiromi Fujiwara博士惠赠; 由逆转录病毒作为载体携带小鼠IL18基因的PA317/IL18、 携带空载体的PA317/LXSN细胞均由日本千叶县癌症研究中心田川雅敏先生惠赠。4～6周龄BALB/c/nu雌性裸鼠（18～20 g）由中国药品生物制品鉴定所（SCXK(京)20000010）提供。G418、 polybrene为美国AMRESCO公司产品; EB、 MTT为Sigma公司产品; TRIzol为美国Gibco公司产品; RTPCR试剂盒为华美生物工程公司产品; βactin、 IL18引物序列查自GenBank， 经Premier5.0软件分析核对， 由上海生工生物技术有限公司合成。ABI5700型PCR循环仪为美国ABI公司产品; FOTODYNE602107型凝胶成像分析系统为美国Image公司产品; H500型透射电镜为日本日立公司产品; Mk353型酶联免疫检测仪为芬兰ThermoLabsystems产品; Vantage流式细胞仪为美国BD公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 小鼠IL18基因转染OVHM细胞 分别取达80%融合的PA317/IL18及PA317/LXSN细胞， 培养24 h后收集病毒原液上清; 取对数生长期OVHM， 将2×105个细胞接种于6 cm培养皿中， 24 h后弃去上清， 加入病毒原液上清及新鲜培液各1 mL， 并加入polybrene（终浓度为8 mg/L）培养3 h后， 补加培养液稀释的polybrene至2 mg/L， 再培养24 h。以终浓度400 mg/L的G418进行阳性克隆筛选， 200 mg/L G418维持逐步扩大培养， 20 d后分别获得转染小鼠IL18的OVHM/IL18和空载体转染OVHM/LXSN细胞[4]。最后经IL18 mRNA及蛋白合成、 分泌的检测， 鉴定转染成功。

　　1.2.2 细胞体外生长增殖、 凋亡状况的检测 将细胞密度调至2.5×107/L， 于96孔板分别培养1～6 d， 观察细胞形态、 折光性及贴壁生长等情况。培养结束前4 h， 每孔加入5 g/L MTT20μL; 培养结束后离心弃上清， 每孔加入DMSO150μL， 振荡10 min， 酶联免疫检测仪检测A570值。调整细胞密度为1×109/L， 加入5 g/L胃蛋白酶， 37℃孵育30 min后离心弃上清; 加入50 mg/L EB染液， 4℃ 30 min， 500目铜网过滤后上机检测。在DNA含量直方图上观察凋亡峰是否出现， 计算凋亡指数（apoptotic Index， APOI）=（凋亡细胞数/所测细胞总数）×100%; 应用DNA细胞周期分析软件计算各时相百分比， 以增殖指数（proliferation index， PI）表示细胞增殖活性， PI=［(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)］×100%。

　　1.2.3 荷OVHM肿瘤小鼠模型的建立及成瘤观察 实验裸鼠于SPF层流室中恒温、 恒湿（45%～50%）环境饲养， 所用垫料、 饮水、 饲料等均经高压灭菌处理。将15只BALB/c/nu裸鼠随机分为3组: OVHM/IL18组， OVHM/LXSN组（空载体对照）， OVHM组（野生型对照）， 每组各5只。分别取对数生长期的细胞， 于裸鼠右前肢皮下接种（2×106个/只）。每日观察小鼠的饮食、 活动等一般状况及肿瘤生长情况。游标卡尺测量瘤体的长径（a）与短径（b）， 计算测量当日的肿瘤体积: V=a×b2/2。于接种后4周末处死， 完整剥离肿瘤， 称取瘤重， 计算成瘤率。

　　1.2.4 荷瘤小鼠肿瘤组织的形态学观察 瘤组织经100 mL/L福尔马林固定， 常规石蜡包埋切片后HE染色观察。另一部分瘤组织， 经40 mL/L戊二醛锇酸双重固定、 脱水、 浸透、 包埋、 聚合、 切片、 染色后， 透射电镜下观察。

　　1.2.5 荷瘤小鼠肿瘤组织中IL18 mRNA表达的检测 βactin 引物为p1: 5′GAT CTT GAT CTT CAT GGT GCT AG3′， p2: 5′TTG TAA CCA CCT GGG ACG ATA TGG3′， 扩增长度764 bp; IL18引物为p1: 5′ATC CCT CGA GAT GGC TGC CAT GTC AGA AGA C3′， p2: 5′GCC CAC GCG TCT AAC TTT GAT GTA AGT TAG T3′， 扩增长度599 bp。TRIzol试剂分别提取瘤组织中的总RNA。RTPCR总反应体系（30 μL）为: RTPCR酶混合物2 μL， 20×缓冲液1.5 μL， dNTP 1.2 μL， MgCl2 2.0 μL， p1、 p2各1 μL， 总RNA 2 μg。混匀后于PCR扩增仪进行基因扩增。IL18扩增参数为， 37℃反转录50 min， 94℃ 5 min; 94℃ 50 s， 55℃ 50 s， 72℃ 50 s; 35个循环后72℃ 10 min。βactin扩增参数为， 37℃反转录60 min， 94℃ 10 min; 94℃ 45 s， 57℃ 45 s， 72℃ 45 s; 35个循环后72℃ 5 min。15 g/L琼脂糖凝胶电泳后， 以凝胶图像分析软件系统(AlphaImager2200， Alpha Innotech) 获取各条带A值。以βactin 表达为内参照， 计算IL18表达强度的相对系数RC=IL18条带A值/βactin条带A值。

　　1.2.6 荷瘤小鼠肿瘤组织中细胞凋亡及周期的检测 取肿瘤组织， 剪碎后200目铜网过滤， 离心收集细胞; 加入50 mg/L EB染液， 4℃ 30 min， 500目铜网过滤后上机检测DNA含量变化及细胞凋亡情况， 在DNA含量直方图上观察凋亡峰是否出现， 并计算APOI及PI。

　　1.2.7 统计学处理 数据均以x±s表示， 采用SPSS11.5统计软件进行方差分析。P&<0.05为有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 转染前后细胞的体外增殖、 凋亡状况 与野生型OVHM比较， OVHM/IL18、 OVHM/LXSN细胞均具典型形态， 折光性、 贴壁状况良好; 3组细胞在相同培养时间的增殖无统计学意义（表1）; 细胞周期分布无明显差异， 均未见明显凋亡峰出现（图1）， PI值亦无明显差异（分别为19.58%±3.04%、 22.41%±2.87%、 24.71%±3.10%， 均P&>0.05）。

　　表1 MTT法检测不同OVHM细胞的增殖（略）

　　Tab 1 The proliferation of different OVHM detected by MTT

　　图1 FCM分析体外培养的不同OVHM细胞周期及凋亡（略）

　　Fig 1 The cell cycle and apoptosis of different OVHM cultured in vitro measured by FCM

　　2.2 IL18基因转染对裸鼠体内OVHM成瘤的影响 3组裸鼠的成瘤率相同，均为100%。OVHM 组及OVHM/LXSN组平均成瘤时间均为(5.5±1.2) d， 随瘤龄增长肿瘤体积明显增大， 裸鼠出现食欲及活动性差、 倦怠等表现。OVHM/IL18组平均成瘤时间为(10.5±1.5) d， 较其他2组晚5 d左右， 有统计学意义(P&<0.01); 裸鼠食欲、 活动情况良好; 随瘤龄增长肿瘤生长缓慢， 肿瘤体积和重量均较其他2组明显减小（表2）。

　　表2 不同组别荷瘤小鼠体内肿瘤的生长（略）

　　Tab 2 The growth of implanted tumor from different cell types

　　aP&<0.05， bP&<0.01 vs groups of OVHM and OVHM/LXSN.

　　2.3 荷瘤小鼠肿瘤组织的形态学观察 大体观察可见， OVHM组、 OVHM/LXSN组裸鼠肿瘤生长呈结节状突出于体表， 瘤体较大， 质脆易出血， 4周后肿瘤表面相继出现破溃，浸润周围组织和皮肤， 界限不清， 不易分离， 切面灰暗， 无明显液化及坏死。OVHM/IL18组裸鼠肿瘤组织体积较小， 肿瘤表面无明显破溃， 无明显周围组织浸润， 易分离。
　　
　　组织切片镜下（图2）， OVHM组、 OVHM/LXSN组瘤组织中瘤细胞密集，胞质丰富， 胞核大而深染， 异型性明显， 核分裂相多见; 间质少， 血管丰富， 偶见脉管瘤栓。OVHM/IL18组瘤细胞数目相对稀少， 胞核较小， 胞质少， 核分裂相少见， 可见散在的胞核与胞质呈固缩坏死样改变， 大片细胞坏死， 间质中血管较少， 可见中性粒细胞及淋巴细胞浸润。

　　图2 荷瘤裸鼠肿瘤组织的HE染色病理形态学观察（略）

　　Fig 2 Pathological morphology of tumor tissues from tumorbearing nude mice staining by HE (×400)

　　A: OVHM group; B: OVHM/IL18 group.

　　电镜观察显示（图3）， OVHM/IL18组裸鼠瘤细胞出现典型凋亡改变: 胞核固缩， 染色质边集呈新月状; 胞质浓缩并有空泡出现， 可见凋亡小体; 细胞器中除粗面内质网轻度扩张外， 其他细胞器数量减少、 体积变小; 微绒毛数量减少等。其他两组瘤细胞胞质丰富， 核浆比例大， 可见核仁， 染色质松散。

　　2.4 肿瘤组织中的IL18 mRNA表达 提取裸鼠瘤组织的总mRNA， 以鼠IL18引物进行RTPCR， 所得599 bp特异性条带为IL18 mRNA条带， OVHM/IL18组种植瘤组织中有IL18 mRNA表达， 而OVHM组及OVHM/LXSN组未见表达(图4) 。

　　图3 荷瘤裸鼠肿瘤细胞的电镜观察 （略）

　　Fig 3 Electron micrographs of tumor cells from tumorbearing nude mice(×15000)

　　A: OVHM group; B: OVHM/IL18 group.

　　图4 荷瘤裸鼠肿瘤细胞的IL18 mRNA表达（略）

　　Fig 4 The IL18 mRNA expression of tumor tissues from tumorbearing nude mice

　　1: βactin; 2: OVHM/IL18 group; 3: OVHM/LXSN group; 4: OVHM group; M: DNA marker.

　　2.5 荷瘤小鼠肿瘤组织中的细胞周期及凋亡状况 FCM检测显示（图5、 表3）， OVHM/IL18组裸鼠体内瘤细胞出现凋亡， APOI明显高于其他2组（均P&<0.05）; G0/G1期细胞明显增多， S、 G2/M期细胞明显减少， PI明显降低（均P&<0.01）。

　　图5 FCM分析荷瘤裸鼠肿瘤细胞的细胞周期及凋亡（略）

　　Fig 5 The cell cycle and apoptosis of tumor cells from tumorbearing nude mice measured by FCM

　　表3 荷瘤裸鼠肿瘤细胞的细胞周期及凋亡（略）

　　Tab 3 The cell cycle and apoptosis of tumor cells from tumorbearing nude mice

　　bP&<0.01 vs groups of OVHM and OVHM/LXSN.

　　3 讨论
　　
　　IL18具有较强的抗瘤效应［5， 6］; IL18的表达缺失在卵巢癌发生发展中发挥了重要作用［3］。由此推测， 将IL18基因导入卵巢癌细胞， 可能对提高机体抗瘤效应有一定的应用价值。
　　体外结果显示， IL18基因成功转染至OVHM并诱导IL18有效表达后， 细胞的形态、 增殖及周期均未见明显变化， 即不能直接影响OVHM的生长增殖及凋亡。但体内荷瘤结果显示， OVHM/IL18组成瘤时间较晚， 随瘤龄增长肿瘤生长缓慢; 瘤组织中存在IL18 mRNA表达; 电镜及FCM观察可见典型的凋亡现象， G0/G1期细胞明显增多， S期细胞明显减少， 增殖指数明显降低， 凋亡指数明显增高。上述结果证实， IL18基因转染虽可纠正卵巢癌细胞的IL18低表达状态， 但并不能发挥对肿瘤细胞的直接毒性作用， 其体内通过阻断细胞周期而产生的促肿瘤细胞凋亡现象， 可能是借助非直接杀伤的其他途径间接发挥的抑瘤作用; 选择IL18作为靶基因对卵巢癌进行基因治疗， 可达到促进肿瘤细胞凋亡， 抑制肿瘤生长的目的。以往的资料表明， IL18可通过诱生IFNγ、 促进树突状细胞成熟、 增强巨噬细胞和NK活性及Th1型免疫反应等提高特异性及非特异性抗瘤免疫， 主要由增强IL2、 FasFasL、 穿孔素等免疫效应分子的表达介导IL18增强免疫细胞的细胞毒性作用［7， 8］。而体外培养的OVHM细胞因没有免疫细胞参与， 也不存在这些介导因素， 故即使IL18基因有效表达， 也不能有效作用于OVHM发挥抗瘤作用。因此， 与空载体转染和野生型OVHM相比， IL18基因转染后OVHM的体外增殖及凋亡情况并无明显变化， 说明在体外无特定的免疫环境存在时， IL18不能发挥有效的抗瘤效应; IL18基因转染后抗瘤效应的发挥， 并不是由IL18的直接细胞毒作用介导的。提示我们， 有必要进一步研究IL18基因成功转染后， 通过胞外分泌对一定接触范围内的免疫细胞产生的促免疫抗瘤活性，及对荷瘤个体抗瘤免疫功能是否具有促进作用。解剖及光镜观察中发现， OVHM/IL18组瘤组织较小、 界限清楚， 血供不丰富， 瘤细胞数量少、 恶性程度较低， 可见中性粒细胞、 淋巴细胞浸润及细胞、 组织坏死; 而野生对照组和空载体组的瘤组织较大、 与周围组织界限不清， 血管丰富， 瘤细胞密集、 恶性程度较高。提示， IL18还可能通过抑制肿瘤血管形成及促进淋巴细胞、 中性粒细胞浸润， 达到抑制肿瘤生长、 降低卵巢癌恶性程度的抗瘤作用。
　　
　　通过对裸鼠体内肿瘤的生长情况观察发现， OVHM/IL18组裸鼠的肿瘤生长速度、 体积及重量均明显低于对照组和空载体组， 但并未表现出对肿瘤生长的完全抑制及成瘤率下降， 可能是由于: （1）实验所用无胸腺裸鼠的T细胞免疫系统功能缺乏， 而T细胞在IL18的抗瘤活性中起重要作用［5］; （2）肿瘤自身存在的一些免疫抑制因素可能在一定程度上抵消了IL18的部分抗瘤作用; （3）是否存在荷瘤机体IL18表达量与其抗瘤效应之间的量效关系。

参考文献

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　　［2］ 乐 杰. 妇产科学［M］. 5版， 北京: 人民卫生出版社， 2000: 339.

　　［3］ Wang ZY， Gaggero A， Rubartelli A， et al. Expression of interleukin18 in human ovarian carcinoma and normal ovarian epithelium:evidence for defective processing in tumor cells［J］. Int J Cancer， 2002， 98(6): 873-878.

　　［4］ 张瑞萍， 云 琳， 彭 玲， 等. 高效转染人T细胞的逆转录病毒载体系统的构建及应用［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2006， 22 (4): 420-422.

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　　［6］ Lian H， Jin N， Li X， et al. Induction of an effective antitumor immune response and tumor regression by combined administration of IL18 and Apoptin［J］. Cancer Immunol Immunother， 2007， 56(2): 181-192.

　　［7］ Telusma G， Datta S， Mihajlov I， et al. Dendritic cell activating peptides induce distinct cytokine profiles［J］. Int Immunol， 2006， 18(11): 1563-1573.

　　［8］ Kitaura H， Tatamiya M， Nagata N， et al. IL18 induces apoptosis of adherent bone marrow cells in TNFα mediated osteoclast formation in synergy with IL12［J］. Immunol Lett， 2006， 107(1): 22-31.