重组人IL12在CHO细胞中高效表达克隆的筛选及产物的生物学活性分析

　　　　　　作者：吕锐， 张文卿*， 于红， 李丹

【摘要】 　　目的: 重组人白细胞介素12(rhIL12)真核表达质粒(pcDNA6/v5hisp70)转染CHO细胞， 筛选高效稳定表达克隆; 并对表达产物进行生物学活性分析。方法: 采用聚乙烯亚胺(PEI)将pcDNA6/v5hisp70转入CHO细胞; 用杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选阳性表达克隆， 并进行单克隆扩增; RTPCR进行表达鉴定; ELISA检测各克隆rhIL12的表达量; 应用淋巴细胞增生实验及细胞内细胞因子染色方法分析rhIL12的生物学活性。同时， 对筛选出的阳性克隆进行表达稳定性观察。结果: RTPCR结果显示， 选取的20个阳性克隆均可扩增出1 800 bp的特异性片段; ELISA 表明， 其中6个克隆rhIL12表达水平较高(312.69～719.10 ng/L)， 最高表达量达到719 ng/L (5×104个细胞， 48 h); 生物学活性分析表明， 表达的rhIL12可明显提高献血员外周血PBMC对 PHA/HCMV反应的CD4/IFNγ及CD8/ IFNγ双标记阳性细胞克隆的频数; 并且， 可明显提高献血员外周血PBMC对PHA/HCMV刺激的增生反应效能。阳性克隆在维持量的筛选药物(2 ng/L Blasticidin)压力下传代6个月， 其表达水平无明显变化。 结论: rhIL12真核表达载体(pcDNA6/v5hisp70)能在CHO细胞中高效稳定表达; 其表达产物具有良好的生物学活性。

【关键词】 白细胞介素 12 中国仓鼠卵巢细胞; 基因表达

　　［Abstract］ AIM: To transfect the constructed recombinant human IL12 (rhIL12) eukaryotic expression plasmid (pcDNA6/v5hisp70) into CHO cells and screen the efficiently and stably expressed clones; and to identify the biological activities of rhIL12. METHODS: pcDNA6/v5hisp70 was transfected into CHO cells using polyethyleneimine (PEI) and positive clones were screened with Blasticidin as well as single clone amplification. Then the expression clone was identified by RTPCR and the rhIL12 expression of each clone was measured using ELISA. Finally， biological activities of the expressed rhIL12 were analyzed with proliferation of lymphocytes in vitro and intracellular cytokine staining(ICS) . The stability of the selected clones was observed as well. RESULTS: The RTPCR results showed that a specific fragment of 1 800 bp could be amplified in all positive clones， among which six clones had rather high expression of 312.69 ng/L-719.10 ng/L with the highest expression of 719 ng/L (5×104 per cells， 48 h) by ELISA test. Biological activities analysis indicated that the expressed rhIL12 could significantly increase the percentage of CD4+IFNγ+ and CD8+ IFNγ+ cells in normal PBMC as well as the proliferation of PBMC to PHA/HCMV stimulation. The efficient expression of positive clones still remained stable after 6 months under maintenance of Blasticidin (2 ng/L). CONCLUSION: The constructed human recombine hIL12 eukaryotic expression vector can express stably with high efficiency in CHO cells and the expressed products show expected biological functions.

　　［Keywords］interleukin12; CHO cells; gene expression

　　IL12主要是由巨噬细胞、 树突状细胞和中性粒细胞产生的细胞因子， 是目前所知对细胞免疫活性诱导和调节作用最强的多功能细胞因子。重组IL12的生物学活性及其治疗作用为近十年研究的热点， 取得了令人鼓舞的成果［1， 2］。rhIL12是目前被认为在肿瘤治疗中最具有研究前途的免疫制剂之一。课题组前期成功地构建了rhIL12单链双亚基共表达真核表达质粒pcDNA6/v5hisp70， 将其转染HEK293细胞瞬时表达， 并进行了表达鉴定。还研究了其对人巨细胞病毒(human cytomegalovirus， HCMV)核酸疫苗的基因佐剂功能及其对实验小鼠肿瘤模型的基因治疗作用［3］。本研究中， 将pcDNA6/v5hisp70转染CHO细胞， 筛选高效稳定表达克隆， 并对其表达产物进行鉴定及生物学活性分析， 为制备rhIL12及其进一步用于研究和开发提供实验。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 rhIL12单链双亚基真核表达质粒(pcDNA6/v5hisp70)、 CHO细胞、 HCMV培养裂解物(1×1010 pfu/mL)由本室构建［4］、 传代保存和制备， 其筛选标记为杀稻瘟菌素(Blasticidin)。培养基RPMI1640购自Gibco公司; 胎牛血清购自杭州四季青生物制品有限公司; 淋巴细胞分离液购自天津TBD公司; 多聚乙烯亚胺(PEI)、 Blasticidin、 四甲基偶氮唑盐(MTT)、 Brefedin A、 PHA均为Sigma 公司产品; 人IL12 (p70)抗体捕捉ELISA试剂盒购自晶美生物工程(北京)有限公司; TRIzol购自Invitrogen公司; 逆转录酶(AMV)购自Promega 公司; 透膜试剂盒(IntraPrepTM Permeabilization Reagent)、 PEmouse antihuCD4、 PEmouse antihuCD8、 FITCmouse antihuIFNγ为法国Immunotech公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 引物设计 pcDNA6/v5hisp70上游引物: p40KS 5′gcggtaccaccatgtgtcaccagcagttggtcatctc3′ (37 bp); 下游引物: p35NotAS 5′ttgcggccgcggaagcattcagatagctcatcactc3′(36 bp)由Sigma公司合成。

　　1.2.2 pcDNA6/v5hisp70转染CHO细胞 CHO细胞培养于含100 mL/L胎牛血清(FBS)RPMI1640培养液中， 置于37℃含50 mL/L CO2的培养箱中孵育。取对数生长期细胞制成单细胞悬液， 调节细胞密度到5×107 /L。应用多聚乙烯亚胺(PEI)转染CHO 细胞［5］。简述如下:溶液A: 5 mol/L NaCl 3 μL(终浓度150 mmol/L)， 10 mmol/L PEI 12 μL(终浓度0.02 μmol/L)， h3O 85 μL， 室温10 min。溶液B: 5 mol/L NaCl 3 μL(150 mmol/L)， pcDNA6/v5hisp70质粒 DNA 4 μg (4 μL)， h3O 93 μL， 室温10 min。溶液C: A 、 B等量混合， 室温10 min。(24孔板上2个转染孔用量)。弃细胞培养孔的培养液， 加无FBS的培养液1 mL/孔， 每孔加溶液C 100 μL，平行转染3孔。37℃ 1 h。加入FBS 110 μL/孔。继续培养24～48 h。转种于细胞培养皿。

　　1.2.3 阳性细胞克隆的筛选 转染细胞在含Blasticidin (终浓度为10 mg/L)的RPMI1640培养液中培养， 每2～3 d更换相同培养液并观察阳性克隆生长情况， 2周后可观察到单克隆形成， 而未经转染的正常CHO细胞在筛选筛选压力下1周内死亡脱落。经胰蛋白酶消化后套取阳性克隆， 转移入24孔培养板中以含维持量的Blasticidin(终浓度为2 mg/L)培养液进行克隆扩增。

　　1.2.4 RTPCR扩增rhIL12 mRNA 用TRIzolTM常规提取各抗性克隆总RNA， 以Oligo(dT)为引物在AMV作用下反转录获得cDNA第1链， 再以此作为模板， 用rhIL12上下游引物p40KS及p35NotAS进行PCR扩增。

　　1.2.5 ELISA法检测rhIL12 收集各阳性克隆24、 48 h的培养上清液(5×104 /孔)。用人IL12p70抗体捕捉ELISA试剂盒检测 rhIL12的表达量， 按试剂盒说明书操作。

　　1.2.6 rhIL12的生物学活性分析 取献血员抗凝血(来自青岛市血站)， 淋巴细胞分离液(Ficoll)常规分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell， PBMC)。分别应用MTT法测定淋巴细胞增生反应及细胞内细胞因子染色(intracellular cytokine stain， ICS)分析表达的rhIL12的生物学活性。PBMC(5×107/L ， 100 μL /孔， 96孔板) 培养于含重组IL12(50 ng/L)营养液中并分别应用PHA(5 mg/L)、 HCMV裂解物抗原(1010 pfu/mL; 5 μL/孔)刺激培养72 h。终止前4 h加MTT (5 g/L)20 μL /孔; 离心弃上清后加DMSO (Sigma) 100 μL/孔; 自动酶标仪(550 nm)测吸光度(A值)。PBMC(109/L) 400 μL/孔(24孔板)培养于含rhIL12 (100 ng/L)的RPMI1640中(100 mL/L胎牛血清)， 同时加PHA(5 mg/L)或HCMV裂解物(1010pfu/mL; 5 μL/孔)刺激72 h; 于最后16 h加Brefedin A ( BFA， 终浓度10 mg/L) 5 μL/孔。分别应用PEantihu CD4/CD8、 FITCantihu IFNγ单克隆抗体(mAb)进行ICS。简述如下: 预冷的PBS洗细胞1次， 用50 μL PBS(0.1 mmol/L EDTA及5 mL/L BSA)重悬细胞， 37℃ 10 min。 分别加PEantihu CD4/PEAntihu CD8 mAb 10 μL， 37℃ 30 min。 PBS洗细胞2次， 加细胞内穿透试剂A(100 μL)， 轻摇混匀， 室温固定30 min。PBS 洗细胞1次， 加细胞内穿透试剂B (100 μL )及FITCantihu IFNγ mAb 10 μL， 轻摇混匀; 室温避光孵育15 min。 PBS 洗细胞2次， Fcm检测PE/FITC双标记阳性细胞的百分率。

　　1.2.7 rhIL12表达稳定性检测 选取6株阳性克隆在含维持量的Blasticidin的培养液中5～7 d传代1次， 连续培养6个月， 用ELISA检测rhIL12表达量。

　　2 结果

　　2.1 CHO细胞转染及阳性克隆的筛选 pcDNA6/v5hisp70转染CHO细胞(CHOIL12)后， 经Blasticidin(终浓度为10 mg/L)筛选， 14 d获得20株抗性细胞克隆; 而正常CHO细胞加筛选压力培养7 d细胞大多数死亡(图1)， 14 d后全部脱落。

　　图1 CHOIL12细胞与CHO细胞加筛选压力后的生长状态（略）

　　Fig 1 Effects of Blasticidin on the growth of CHOIL12 and CHO cells(×100)

　　A: Positive clones of CHOIL12(14 d); B: CHO cells(7 d).

　　2.2 RTPCR进行rhIL12表达鉴定 提取抗性细胞克隆的总RNA， 经RTPCR扩增， 均获得特异的rhIL12 cDNA片段(1 800 bp)(图2)。

　　2.3 ELISA检测rhIL12表达量 ELISA检测显示， 20株阳性克隆培养上清液中均可检测到rhIL12表达产物， 其中有6株表达水平较高， 分别为312.69、 336.77、 436.54、 523.35、 570.78、 719.10 ng/L (平均483.2 ng/L， 5×104细胞， 48 h)。

　　2.4 rhIL12的生物学活性分析 献血员的PBMC 在rhIL12的作用下， 对PHA非特异性及HCMV特异性刺激的增生反应能力明显增强(t=2.707， P&<0.05; t=3.318， P&<0.05)。表明获得的rhIL12具有预期的生物学活性。ICS结果表明， rhIL12可以明显增加献血员PBMC对PHA 及HCMV反应的 CD4+/IFNγ+及CD8+/IFNγ+ T 双标记阳性细胞的频数。对CD4+/IFNγ+克隆活化作用比单独应用PHA增加17倍(5.0/0.3)， 对CD8+/IFNγ+ T克隆活化作用增加近5倍(4.55/1.055)。对HCMV抗原特异性CD4+/IFNγ+ 及CD8+/IFNγ+克隆活化作用比单独应用HCMV均增加1倍以上(5.82/2.46， 7.78/3.76， 图3)。

　　图2 CHOIL12细胞克隆的RTPCR鉴定 （略）

　　Fig 2 RTPCR analysis of rhIL12 expression in the CHOIL12 colones

　　1: DL 2 000 marker; 2-10: RTPCR products; 11: Negative control.

　　图3 rhIL12增加PBMC 对PHA、 HCMV 反应的CD4/CD8及IFNγ双标记阳性细胞百分率（略）

　　Fig 3 Effects of rhIL12 on percentage of CD4+IFNγ+ /CD8+ IFNγ+ cells to different stimuli

　　2.5 rhIL12表达稳定性检测 6株阳性表达克隆在含维持量Blasticidin的培养液中连续培养6个月， 经3次冻存、 复苏， rhIL12表达水平无明显变化。

　　3 讨论
　　
　　本课题组成功构建和筛选了rhIL12稳定高效表达细胞系， 为其后利用基因工程方法生产rhIL12建立了平台， 也可为临床病毒性疾病、 肿瘤及多种自身免疫性疾病的治疗开辟新的研究领域。
　　Otmane等［5］研究证明， PEI对多种哺乳动物细胞(3T3、 COS7、 HepG2、 K562、 HeLa、 MRC5)均具有较强的转染能力。我们应用PEI成功地将pcDNA6/v5hisp70导入CHO细胞。在7 cm的细胞培养皿中， 获得阳性克隆20余个; RTPCR 结果显示， 所有的阳性克隆均有rhIL12的特异性表达， 表明其转染效率较高。而且，该方法操作简单， 成本低廉(不需要购买转染试剂盒)， 适用于一般的实验室。对其中6个克隆扩增并进行表达产物鉴定， ELISA检测结果显示， 其表达量平均为483.2 ng/L， 最高达到719 ng/L， 5×104 细胞(48 h)， 与李昌麟等［6］报告的结果相近(0.1 μg/106细胞)。阳性克隆在维持量的筛选压力作用下传代6个月(经几次冻存、 复苏)， 其表达水平未见明显变化。研究结果表明， 筛选到的CHOIL12可稳定、 高效地表达rhIL12。
　　
　　我们分别应用淋巴细胞增生及ICS分析rhIL12的生物学活性。由于我国人群HCMV感染率在90%以上［7］， 即体内有HCMV特异性记忆细胞， 故直接采用HCMV培养裂解物刺激献血员PBMC， 以使其HCMV 特异性T细胞克隆激活并扩增。研究结果显示， rhIL12可明显增强献血员PBMC对PHA非特异性及HCMV特异性刺激的增生反应能力。ICS检测结果表明， rhIL12不仅能增加献血员PBMC对PHA及HCMV刺激发生反应的CD4/CD8细胞的数量， 而且伴有其免疫应答效能(产生IFNγ)的增强。因为ICS能够对参入应答的淋巴细胞亚群的数量及功能进行双向分析［8］。因此， 无论对特异性或非特异性刺激， ICS 用于体外评价rhIL12 的生物学活性比常规淋巴细胞增生反应更为敏感和精确。
　　
　　随着对IL12研究的深入， 使用rhIL12调节肿瘤患者的免疫应答成为肿瘤治疗的一个新策略， 已被广泛地应用于多种肿瘤的免疫治疗研究［3］。因此， rhILI2在真核细胞中高效稳定表达细胞系的建立， 对于进行rhILI2的理论和临床应用研究均具有重要的意义。

参考文献

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