同种异体骨髓间充质干细胞复合胶原海绵修复兔桡骨缺损的实验研究

　　　　 作者：杨柏林，潘勇，云雄，邹重文，曹国永

【摘要】 目的：了解兔骨髓间充质干细胞(BMscs)同种异体移植的存活分布情况及同种异体兔BMscs复合胶原海绵(CS)情况，观察其对兔桡骨1.5 cm缺损的修复效果，为将来的进一步应用奠定实验基础。方法：采集、培养、纯化扩增新西兰大白兔BMscs，用eGFP荧光标记BMscs，与胶原海绵联合培养，植于同种异体动物臀大肌，观察存活及分布情况。建立兔桡骨缺损(1.5 cm)模型，45只新西兰大白兔随机分为3组：同种异体BMscs/CS组(A组)，单纯胶原海绵组(B组 )，空白对照组(C组)。术后分阶段行X线、组织学检查及生物力学检查，评价其修复效果。结果：eGFP标记的BMscs异体移植存活时间超过3周。X线示12周A组大白兔5只中有4只达到骨性连接。新生骨量呈A组C组递减，至12周无一愈合。随着时间推移，A组编织骨髓腔和骨小梁增多，修复过程优于B、C组。A组生物力学指标均低于健侧正常对照组，但各指标能达到正常组的80%～90%。结论：同种异体MSCs复合CS可以修复1.5 cm兔桡骨缺损。

【关键词】 骨髓间充质干细胞;组织工程;移植;骨缺损

　　　　 [ABSTRACT] Objective:To study the survival and distribution of allogenic mesenchymal stem cells (BMscs) after implantation into other rabbits， evaluate osteogenetic effectiveness of collagensponge mixed with allogenic BMscs of rabbit in repairing of radial shaft defects， and lay the foundation for further application.Methods: The BMscs of New Zealand white rabbits were collected，cultured，purified and amplified，they were marked with eGFP， cultured with collagensponge and planted into ectogluteus of other rabbits in order to observe the survival and distribution of BMscs. Model of radial bone defects (15 mm )of rabbits was established. 45 rabbits were pided into 3 groups， group A (BMscs/CS group)， group B (CS group) and group C (untreated group). Roentgenographic， histologic， biomechanics indexed of the animals were examined at certain time after surgery to evaluate osteogenetic effectiveness.Results: The BMscs marked with eGFP could survive for 3 weeks. On the 12th week， 4 of 5 radial bone defects healed in group A.The quantity of callus decreased from group A to C. In group B and C， no one rabbits healed on the 12th week. Biomechanics result showed the indexes of group A were lower than the opposite side normal control groups.Conclusion: BMscs mixed with CS can repair radial defect shorter than 1.5 cm in rabbit.

　　[KEY WORDS] Bone marrow mesenchymal stem cells; Tissue engineering; Transplant; Bone defects

　　利用组织工程的方法治疗骨缺损，是目前骨科基础研究的热点之一。目的基因、种子细胞、支架材料是组织工程三大要素，种子细胞作为其中一项要素引起了广泛的研究[1，2]，其中骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells， BMscs )是研究较多的种子细胞之一。传统的自体细胞移植在实验室研究阶段存在着大量细胞取材困难，宿主存活时间难以保证，不同宿主细胞容易混杂污染等缺点。研究发现BMscs可有效绕过机体的免疫排斥进行异体移植，基于此本文将异体BMscs复合胶原海绵，对兔1.5 cm桡骨缺损修复进行了实验研究。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　优质胎牛血清(杭州四季青公司);DMSO(上海生化试剂二厂);MTT(美国Sigma公司);Percoll分离液(密度1.073 g/mL，天津TDB公司);DMEM/F12培养基(美国Gibco公司);胰蛋白酶(美国Amesco公司);注射用肝素钠、注射用链霉素、速眠新(华北制药股份有限公司);胶原海绵(北京益而康公司)新西兰大白兔(第三军医大学大坪医院动物中心);eGFPAd由重庆武警总队医院曹国永博士提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 兔BMscs的分离 根据

参考文献

[3]将幼兔肌注速眠新麻醉，无菌环境下解剖出四肢长骨，剪断两端，用10 mL肝素钠(1200 U/mL)湿润过的骨穿针抽取骨髓共2.5 mL，至10 mLDMEM/F12培养液中，抽吸、吹打使骨髓组织基本均匀分散，缓慢加入含10 mL Percoll细胞分离液的离心管中，以2 000 rpm的转速离心20 min。缓慢吸取中间的白膜状层细胞至另一离心管中，加入PBS平衡液吹洗后，以1 500 rpm的转速离心5 min，弃去上清。洗涤，加入6 mL 不含血清的DMEM/F12培养液，轻轻吹吸，重悬为单细胞悬液后准备培养。

　　1.2.2 BMscs的培养 吸取2 mL重悬细胞液，接种到100 cm2玻璃培养瓶中，再加入5 mL完全培养液，添加血清至终浓度未10%。置于37 ℃、5%CO2的空气、饱和湿度的培养箱内培养。24 h后半量换液，72 h后完全换液，以后隔日换液。待细胞长至瓶底80%面积时，以1∶3比例用0.25%的胰蛋白酶消化传代。0.25%胰蛋白酶消化生长状态良好的第三代细胞，离心，洗涤，加入冻存液中重悬，梯度降温，置于液氮中。复苏时取出细胞在空气中置5 sec，水浴加热，洗涤，离心后加入完全培养基重悬。

　1.2.3 eGFPAd转染兔BMscs 取冻存复苏后的细胞，吸干培养基，以感染复数MOI=150将标记有eGFP的腺病毒eGFPAd液加入培养瓶，培养箱中孵育1 h，加入完全培养基培养过夜，12 h后倒掉原液，加入完全培养基培养。

　　1.2.4 eGFPAdBMscsCS复合材料的观察及生物相容性观察 取生长状态良好的eGFPAd修饰的BMscs细胞，待细胞融合率达80%后，消化成细胞悬液，调整浓度为5×106/mL，用注射器注入1 cm×1 cm×0.5 cm胶原海绵，使其浸入内部，添加培养液后置孵箱内继续培养24h，得到含BMscs的胶原海绵复合物。

　　将上述方法获得的eGFPAdBMscsCS复合材料取出，PBS清洗，2.5%戊二醛固定，乙醇和丙酮梯度脱水，和CS一起临界点干燥后喷金，扫描电镜观察。

　　1.2.5 eGFP标记的BMscs体内示踪观察 将纯种新西兰大白兔麻醉，消毒后手术显露右侧臀大肌，将两块0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm复合材料植入肌肉内，分别于术后3 d、1周、3周、5周取出材料(附带部分肌肉)，4%多聚甲醛固定，冰冻切片，厚度5 μm，荧光显微镜下观察。

　　1.2.6 兔桡骨缺损模型的建立 选择45只纯种新西兰大白兔，每组15只，速眠新麻醉，固定四肢，左上肢剪毛，常规消毒，铺巾。上肢后外侧中份纵切口2～3 cm，钝性分离肌肉，暴露桡骨中段，拨离骨膜，用线锯横行锯断桡骨，形成1.5 cm宽骨缺损，A组予以异体BMscs/ CS复合物填充;B组予以CS填充;C组空白对照，随后分层缝合，术后分笼饲养。

　　1.2.7 影像学观察 手术后术后4、8、12周行前肢正位X线摄片，了解缺损区骨痂生长塑形及髓腔再通情况。每时间点每组5只，采用柯达DR3000射线机，60 kV，8 mA.s条件下曝光，影像科高年资医师读片，采用Tsuchida H和Hashimoto J[4] 等人推荐的计分系统，根据缺损内新生骨所占的百分比对成骨情况进行半定量评分。

　　评分标准如下：新生骨面积百分比1%～24%计1分;25%～49%计2分;50%～74%计3分;75%～99%计4分;100%计5分。

　　1.2.8 组织学观察 分别于术后4、8、12周每组选择5只动物处死，于缺损填充部位取材，经固定、脱钙、包埋、HE染色，光镜观察骨缺损修复及成骨情况。

　　1.2.9 生物力学测定 术后12周取A组中达到骨性连接标本和健侧相应的正常标本各4例，取全长桡骨，两端经牙托粉固定。测定压缩试验，加载速度1 mm/min，应力下降50%～60%停止加载。比较力学最大载荷、抗压强度和弹性模量各指标。

　　2 结果

　　2.1 原代BMscs 显微镜观察结果

　　BMSC形态与成纤维细胞类似，呈纺锤形，有少量细胞突起。随着换液的进行，出现集落状细胞群，由10～20个细胞组成，此后细胞集落迅速增多，融合成片，呈旋涡状排列， 9～12 d细胞铺满瓶底成单层，见图1。

　　图1 倒置显微镜下原代BMscs图象(×100)

　　2.2 胶原海绵及eGFPAdBMscsCS复合体扫描电镜观察结果

　　胶原海绵疏松多孔，大小不均。复合材料扫描观察见BMscs在CS支架材料上伸展良好，细胞融合成片状，细胞与周围材料紧密相连，少数成球形(图2)。

　　2.3 eGFP标记的BMscs体内示踪观察结果

　　术后3 d，冰冻切片在荧光显微镜下可见移植区大量eGFP阳性细胞。术后7 d可见少许减弱，在胶原海绵外周边组织亦发现有少许eGFP阳性细胞。3周后荧光明显减弱，5周后消失。

　　2.4 X线观察结果

　　A组：4周时缺损处少许骨痂生长，8周时大量骨痂形成。12周时，5例中有4例有连续骨痂通过，新生骨塑形改建。

　　B、C组：4周时缺损处空虚，至12周仍无1例愈合，形成骨不连。但B组骨痂多于C组。见图3。

　　图2 胶原海绵及EgfpAdBMscsCs复合体扫描隧道显微镜图像(×700)

　　图3 A、C组X线图像

　　X线骨形成评分结果显示，4周时A、B、C组评分值分别为(3.8±0.5)、(0.8±0.4)和(0.7±0.4);8周时各组评分值分别为(4.7±0.9)、(1.5±0.5)和(1.0±0.0);12周时分别为(4.3±0.4)、(1.5±0.5)和(1.0±0.0)，在各时间点A组评分均高于B、C组，且差异有统计学意义(P&<0.05);B、C组间评分值差异无统计学意义(P&>0.05)。

　　2.5 组织学观察结果

　　A组修复过程4周时以纤维骨痂和软骨组织为主，含大量软骨细胞;8周时编织骨开始增多，出现骨小梁，部分标本出现髓腔;12周时髓腔和骨小梁进一步增多，但髓腔内骨髓细胞少见。

　　B、C两组修复过程类似，可见纤维组织增生，12周时缺损区填充纤维组织，仅有少量骨组织形成，最后缺损处形成纤维连接(见图4)。

　　图4 A、C组组织修复图像

　　2.6 生物力学测定

　　A组的最大载荷、抗压强度和弹性模量分别为(87.8±9.8)N、(8.4±0.9)Mpa及(187.5±8.2)Gpa，均低于健侧组[(112.3±11.2)N、(9.5±0.2)Mpa及(210.5±15.9)Gpa]，且结果有统计学意义(P&<0.05)。

　　3 讨论

　　BMscs最初是由Friedenstein[5]提出，1987年Friedenstein发现一类易于贴附于塑料培养板表面的成纤维细胞样细胞，具有多向分化潜能，特定条件下可向成骨细胞、成软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞等细胞分化[6]。骨髓中MSC的数量有限，含量极低，通常105～106个骨髓有核细胞中仅有1个MSC[7]。故如何从体外获取、纯化MSC并使其高效快速增殖成为组织工程技术应用和推广的热点问题。

　　密度梯度离心法利用MSC与其他细胞的密度不同，用特定密度的淋巴细胞分离液将MSC分离出来，该法所获得的细胞种类单一，细胞纯度高，可以满足组织工程研究的要求。本实验采用密度梯度离心法得到MSC后采用贴壁培养法，通过传代将MSC纯化，其原理如下：首先利用MSC与其他有形成分的密度不同，通过密度梯度离心法有效地将绝大部分红细胞、粒细胞、脂肪细胞和血小板除去，获得纯度较高的单个核细胞。再通过贴壁培养和换液可除去悬浮生长的血细胞。通过传代3次，本实验所看见细胞形态一致，杂质细胞少见，从而达到了有效的分离和纯化。

　　目前，关于MSC的鉴定也无统一的标准。BMscs表面标志物具有非单一性的特性，它不表达造血谱系标志物 CD11，CD45，CD34，而表达CD44，CD71，CD90[69]。由于其表面标志的非专一特性，目前还没有筛选到MSC特异的分子标记，其鉴别主要是综合判断[10]。本实验获得的细胞从形态看，MSC呈均一的成纤维细胞形态，贴壁生长为梭形、三角形，各代之间形态单一，结合其分离方法分析，符合BMscs的特征。

　　研究还发现BMscs可有效绕过机体的免疫排斥进行异体移植，从而极大的方便了BMscs的应用。在鼠、兔等多种动物体内进行的同种异体移植试验中，均未发现明显的免疫排斥反应。在人的体外实验研究中，将取自与hBMscs供者无关的淋巴细胞与hBMscs共存培养，hBMscs并不激发T细胞增殖，反而抑制混合细胞群淋巴细胞性的反应。Lieehty[11]等将人BMscs体外培养后，移植入妊娠早期羊胚胎囊腔内，发现人BMscs可分化出多种细胞，并且在胎羊内存活超过13个月。关于BMscs逃避宿主免疫排斥的机制可能为：(1)BMscs的低免疫原性。BMscs主要表达MHCI型分子，不表达或极少表达MHCII型分子，而MHCI型分子可以保护BMscs免受NK细胞对其造成杀伤[12]。(2)BMscs抑制T细胞的增殖[13]，或调整其表型来抑制正常的免疫排斥反应[14]。(3)BMscs分泌多种可溶性因子[15]如IL6、IL7、IL8、IL11、IL12、IL14、IL15、IL27、白血病抑制因子(leukaemia inhibitory factor)、干细胞因子( stem cell factor)、肝细胞生长因子(Hcpatocytc growth factor)等。这些因子可能促进了局部免疫抑制微环境的形成。同时，本实验采取深低温冻存可能改变了其表面的抗原结构，使受者对其免疫反应性下降，出现免疫耐受。实验观测示植入的BMscs可在宿主内存活3周，证实了以上观点。实验还发现植入的细胞在局部聚集，周围组织含有少量细胞，也说明了支架材料与种子细胞粘附良好，同时BMscs有一定的迁移能力，具有活跃的细胞功能。

　　体内实验从病理学和影像学指标上显示了无论是在骨缺损修复速度还是新生骨成骨数量A组处理对象均超过其它组，验证了BMscs具有一定的修复骨缺损能力，而B、C组无显著性差异，这证明单纯胶原海绵支架材料植入并不能修复1.5 cm兔桡骨干缺损。在A组的生物力学实验结果上，虽然力学性能实验组低于健侧正常组，但是在最大载荷、弹性模量和抗压强度上仍达正常值的78.2%，88.4%和89.3%，说明同种异体BMscs移植是一种有效的方法。但是针对具体移植后BMscs的转归和免疫学变化还有待于进一步研究。

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