NO参与AngⅡ诱导心肌成纤维细胞胶原含量的变化

　　　　　　 作者：周有华， 王杨，董战玲 ，符史干

【摘要】 目的：探讨NO前体LArg和NOS抑制剂LNAME在血管紧张素Ⅱ诱导CFs胶原合成中的作用。方法： 用胰酶消化法分离、纯化、培养新生SD大鼠CFs， 采用CFs羟脯氨酸含量测定、以羟脯氨酸标准曲线求出样本中羟脯氨酸含量，胶原含量以羟脯氨酸含量×7.4表示。结果：(1)在培养液中加入AngⅡ109～105 mol/L，CFs胶原含量呈明显的剂量依赖性;(2)分别给予Saralasin和PTX对CFs胶原含量均无明显影响，但可明显抑制AngⅡ增强CFs胶原含量的作用;(3)预先给予NO前体LArg，再加入AngⅡ，AngⅡ增加CFs胶原含量的效应明显减弱;(4)加入NOS抑制剂LNAME后，再加入LArg和AngⅡ，明显减弱LArg对AngⅡ的抑制作用;(5)在用LNAME抑制NOS的基础上，再加入AngⅡ，其AngⅡ促心脏CFs的作用进一步增强，而单纯应用LNAME对基础状态CFs胶原含量无明显影响。结论：AngⅡ能剂量依赖性增加 CFs胶原含量，此效应是通过AngⅡ受体实现的，可能部分依赖于PTX敏感的G蛋白;NO明显抑制AngⅡ增加CFs胶原含量的作用，CFs内可能存在LArgNO通路，该通路在调控AngⅡ增加CFs胶原含量中有重要作用。

【关键词】 血管紧张素Ⅱ;一氧化氮;心肌成纤维细胞;Saralasin;百日咳毒素;NG硝基左旋精氨酸甲酯

　　 [ABSTRACT] Objective: To investigate the effects of nitric oxide(NO)precursor LArg and NOS inhibitor LNAME on collagen synthesis induced by angiotensin Ⅱ(Ang II) in cardiac fibroblast (CFs). Methods: The CFs of neonatal SD rat were separated， purified and cultured using trypsin digestion method. Hydroxyproline concentration of CFs was determined and calculated by hydroxyproline standard curve， and the collagen concentration was equal to 7.4 times of hydroxyproline concentration. Results: (1) When adding Ang Ⅱ to the culture solution at the dosage of 10-9 ～ 10-5 mol / L， collagen concentration increased in a dosedependent manner. (2) Saralasin and PTX had no significant effects on collagen concentration of CFs; however， they can inhibit AngⅡ from inducing collagen sythesis in CFs. (3) Adding NO precursor LArg before Ang Ⅱ can significantly weaken the inducing effects of AngⅡ in CFs collagen sythesis. (4)The effects of LArg may be inhibited by pretreatment of LNAME， a NOS blocker. (5) The inducing effect of Ang Ⅱin CFs collagen sythesis was strengthened by NOS blocker LNAME. Conclusions: These results indicate that collagen concentration of CFs can be significantly increased by Ang Ⅱin a dosedependent manner， which was mediated by Ang Ⅱreceptor and probably may be partially dependent on PTx-sensitive G protein. NO can significantly inhibited Ang Ⅱform the inducing collagen sythesis. The LArgNO pathway may exist in CFs and probably play an important role in the process of the collagen sythesis induced by Ang Ⅱ.

　　[KEY WORDS] AngiotensinⅡ; Nitric oxide; Cardiac fibroblasts; Saralasin; Pertussis toxin; NGnitroLargingie methyl ester (LNAME)

　　心脏由心肌细胞和以胶原为主的细胞外基质(extracellular matrix， ECM)组成。心肌细胞占心脏总体积的75%，但细胞数仅占心脏细胞总数的1/3，其余2/3为非心肌细胞，包括心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts， CFs)、内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞等，其中CFs达90%以上。CFs是心肌细胞外间质改建的主要细胞，虽无收缩功能，但具有增殖能力，可产生和分泌胶原、纤维粘连蛋白等ECM，从而导致心脏间质胶原累积、血液供应障碍及功能(特别是舒张功能)受损。CFs在心脏组织结构及功能的重构中具有重要的作用[13]，它参与心脏重构(Cardibc remodelling)的3个过程，即心肌细胞肥大、CFs增殖和ECM的累积。一方面，CFs在未受到刺激时具有旁分泌功能，能分泌肥大因子促进心肌细胞肥大[4，5];另一方面，某些生长因子如AngⅡ[6]和去甲肾上腺素[7]既可促进CFs增殖，也能通过CFs分泌生物活性物质来介导心肌细胞肥大。心肌细胞外间质数量和质量的改变可增加心肌舒张阻力 ，促进组织内电弥散 ，易于发生心律失常、心力衰竭和心性猝死[8]。新近的研究表明，NO可抑制AngⅡ诱导的CFs增殖和DNA合成速率[9]。但是AngⅡ对新生大鼠心脏CFs胶原合成及其机制尚未完全清楚，NO在AngⅡ对心脏CFs影响中是否起作用也未完全阐明。本实验通过纯化培养新生大鼠的CFs，检测CFs羟脯氨酸含量的变化，以羟脯氨酸含量×7.4表示CFs胶原含量，探讨NO在AngⅡ诱导心肌成纤维细胞胶原合成中的作用及其机制，为心肌纤维化的发生机制和临床防治提供的实验资料。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　1～3 d龄SpragueDawley(SD)大鼠，雌雄不拘，由中山大学医学院实验动物中心提供。

　　1.2 乳鼠心脏成纤维细胞纯化培养[10]

　　1～3 d龄SD大鼠，在无菌条件下开胸取心脏，立即置入4 ℃ DHanks液(NaCl 137、KCl 5.4、Na2HPO4 0.37、K2HPO4 0.44、NaHCO3 4.2 mmol/L)中截取心室肌，洗净残血，剪成约1 mm3大小的组织碎块。弃去DHanks液加入0.08% 胰蛋白酶液10～15 mL，于37 ℃磁力搅拌消化10 min，吸出上层悬液，并加入等量含血清培养基，经中止消化后离心(2 000 rpm/min，5 min)弃上清。再加入胰蛋白酶消化液消化10 min， 如此重复消化6～8次，分别收集各次细胞悬液，加入含血清的培养液，吹散沉淀细胞，同条件下再次离心。 将各次离心沉淀后的细胞合并，用10% 血清培养液制成细胞悬液，置37 ℃，5%CO2培养箱内。根据心肌细胞与非心肌细胞贴壁时间的不同，采用2 h差速贴壁，分别获得心肌细胞和CFs。CFs培养至第6天传代，实验用第2～5代细胞。所有细胞均2 d换液1次。

　　 1.3 心脏CFs羟脯氨酸含量测定

　　差速贴壁法分离心脏CFs，传代培养，取培养2～5代细胞，0.125%胰酶消化细胞后，制成细胞悬液，等量(1 mL)接种于24孔板，常规培养72 h分别换入含AngⅡ或所选各种干预因子的0.5%胎牛血清的DMEM培养液，继续培养48 h后，以Kivikikko法[11]测定CFs羟脯氨酸(hydroxyproline)含量。每组测定6孔细胞，取其平均值。因可水解的羟脯氨酸为胶原特异性羟脯氨酸，其含量在胶原中基本恒定(约占13.6%)，故所测培养CFs胶原含量以羟脯氨酸含量×7.4表示，以此推算出培养心脏CFs胶原含量[12]。心脏CFs羟脯氨酸测定方法如下：以5%三氮乙酸(TAC)提取2次，提取液混合，加终浓度为5.7 N的盐酸，在具塞试管内放置110 ℃烘箱水解24 h。取水解液加氧化剂(氯胺T溶液)，放置25 min，加Ehrich's试剂(1%对二甲氨基苯甲醛)，80 ℃水溶液显色20 min，自来水冷却5 min，紫外分光光度计(CE2020型，英国)560 nm处测定样本OD值。羟脯氨酸标准另配成标准液，分别为2.0，4.0，8.0，10.0 μg/mL，蒸馏水为空白对照，做标准曲线。羟脯氨酸标准曲线回归方程为：Y=18.58D0.035，相关系数r=0.999 96(P&<0.001)。通过标准曲线求出样本中羟脯氨酸含量，胶原含量以羟脯氨酸含量×7.4表示[13]。

　　1.4 主要试剂与药品

　　(1)DMEM培养基： BOEHRINGER MANNHEIM公司产品，由去离子双蒸水配制，正压过滤除菌，pH 7.2， 4 ℃保存。(2)Hanks液组成(mmol/L):NaCl 137，KCl 5.4，MgSO4 0.81，Na2HPO4 0.37，K2HPO4 0.34，NaHCO3 4.2，Glucose 5.0，三蒸水配制，pH 7.2，高压蒸汽灭菌，4 ℃保存。(3)DHanks酶消化液：胰蛋白酶(Difco进口分装，1∶250) 用无钙镁的Hanks液配制成0.08%液，pH 7.2，经0.22 μm微孔滤膜除菌后，20 ℃保存。(4)胎牛血清：中国医学科学院血液学研究所产品，20 ℃保存。(5)含血清培养液： DMEM培养液临用前加入10%胎牛血清、青霉素100 U/mL，链霉素100 μg/mL。(6)无血清培养液DMEM培养液：胰岛素10 μg/mL，转铁蛋白 10 μg /mL，VitC 100 mol/L，VitB12 1.5 mol/L，青霉素100 U/mL，链霉素100 g/ml。(7)血管紧张素II (Angiotensin II， AngII):Sigma公司产品，分子量为1 046.2，八肽(AspArgVolTyrLieHisProPhe )，无菌条件下配成10-4 mol/L溶液，20 ℃保存。(8)Saralasin：血管紧张素II受体拮抗剂，Sigma公司产品，分子量为912.1。(9)百日咳毒素(pertussis toxin，PTX):Sigma公司产品。(10)L精氨酸：Sigma公司产品，分子量为174.20。(11)NG硝基左旋精氨酸甲酯(NGnitroLargingie methyl ester， LNAME): Sigma公司产品，分子量为269.7。

　　1.5 统计学处理

　　所有数据输入计算机，用SPSS 13.0 for Windows统计软件包进行t检验和单因素方差分析，数据以均数±标准差(±s)表示，以P&<0.05作为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 AngⅡ对心脏成纤维细胞培养液胶原含量的影响

　　在培养液中加入AngⅡ 1×109、1×108、1×107、1×106、1×105 mol/L，心脏成纤维细胞胶原含量分别为(68.3±8.4)、(86.2±10.5)、(101.1±13.6)、(119.9±14.3)和(123.3±14.2) μg/(mg·pr)，5组AngⅡ与对照组[(59.6±7.8) μg/mg·pr)]相比，除1×109 mol/L组差异无统计学意义，其余各组均差异有统计学意义(P&< 0.05～0.001)，并呈现明显的剂量依赖性，但1×106 mol/L组 与1×105 mol/L组相比差异无统计学意义(图1)。

　　2.2 AngⅡ受体拮抗剂Saralasin的作用

　　单纯给予AngⅡ受体拮抗剂Saralasin 1×107mol/L，CFs胶原含量为(62.1±8.1) μg/(mg·pr)，与对照组相比无统计学意义，但是，预先给予Saralasin，再给予AngⅡ 1×107 mol/L，则可明显抑制AngⅡ增强CFs胶原含量的作用，见图2。注：与对照组比较，**P&<0.01，与AngII组比较，△P&<0.05。

　　2.3 PTX的作用

　　用百日咳毒素(pertussis toxin， PTX)1×106 mol/L预处理CFs 24 h，再加入AngⅡ1×107 mol/L，CFs胶原含量为(73.6±9.8) μg/(mg·pr)。明显阻断AngⅡ增加CFs胶原含量的作用，与单纯AngⅡ组比较差异有统计学意义(P&<0.01);单纯应用PTX预处理，CFs胶原含量为(56.9±7.7) μg/(mg·pr)，与对照组相比差异无统计学意义(P&>0.05)，见图3。提示AngⅡ促CFs胶原合成增加，可能部分通过PTX敏感G蛋白介导。

　　2.4 NO在AngⅡ诱导CFs胶原含量中的作用

　　2.4.1 LArg的作用 单纯给予NO前体LArg 1×104 mol/L，CFs胶原含量为(51.9±8.5)μg/(mg·pr)，与对照组相比差异无统计学意义，但预先给予LArg，再加入AngⅡ(1×107 mol/L)，则AngⅡ增加CFs胶原含量的效应明显减弱，见图4。

　　注：与对照组比较，**P&<0.01，与AngII组比较，△P&<0.05。

　　图3 PTX 在AngII对培养新生大鼠心脏成纤维细胞胶原含量影响中的作用(n=8)注：与对照组比较，**P&<0.01，与AngII组比较，#P&<0.05。

　　图4 L精氨酸在AngII对培养新生大鼠心脏成纤维细胞胶原含量影响中的作用(n=8)

　　2.4.2 LNAME的作用 实验分成5组：(1)对照组;(2)LArg(1×104 mol/L)+ AngⅡ(1×107 mol/L)组;(3)LNAME(1×105 mol/L)组;(4)LNAME+ LArg+ AngⅡ组;(5)LNAME+ AngⅡ组。预先在培养液中加入NOS抑制剂LNAME后，再加入LArg和AngⅡ，明显减弱LArg对AngⅡ的抑制作用;在用LNAME抑制NOS的基础上，再加入AngⅡ，其AngⅡ促心脏CFs的作用进一步增强;单纯应用LNAME对基础状态心脏CFs胶原含量无明显影响，见图5。注：与对照组比较，**P&<0.01;与AngII组比较，#P&<0.05;与LArg+AngII组比较，△P&<0.05。

　　3 讨论

　　近年来已认识到CFs和心肌间质在心肌重构中起着不可忽视的作用。心脏重构是一个复杂的过程，包括心肌细胞的肥大、CFs增殖和ECM的沉积[13]。CFs在心脏重构中起重要作用，它参与3个重构过程。Ashizawa等报道，大鼠心室CFs分泌成骨素(osteopontin)，介导AngⅡ促进CFs增殖和胶原[14]。而Yu等报道，CFs能分泌前列腺环素(prostacyclin)抑制其自身的胶原合成[15]。上述结果提示，CFs具有旁分泌作用、促进心肌细胞肥大以及CFs本身的增殖和肥大。心肌纤维化与多种内源性的神经内分泌和细胞因子的激活有关，CFs是心肌纤维化的主要效应细胞。许多促细胞生长因子，如AngⅡ、ET1、CT1等都能调控CFs生长和心肌胶原代谢[16，17]，AngⅡ通过作用于CFb上的 AT1 受体 ，引起 CFb增殖、胶原合成增加 ，导致心肌纤维化的发生[18]。本实验结果显示，在培养新生大鼠心脏CFs中，AngⅡ能明显增加CFs培养液胶原含量，且具有明显的剂量依赖性，表明AngⅡ可促进心脏ECM沉积。AngⅡ受体拮抗剂Saralasin对基础状态CFs胶原含量无明显影响，但能阻断AngⅡ促CFs胶原含量的作用;G蛋白抑制剂PTX本身对CFs胶原含量无明显影响，但可明显削弱AngⅡ对CFs胶原含量的效应，提示AngⅡ增加CFs胶原含量是通过AngⅡ受体实现的，可能部分依赖于PTX敏感的G蛋白。

　　NO是强舒张血管、抑制心肌纤维化的活性物质 ，在病理条件下 ，如高血压、高血脂、糖尿病、动脉粥样硬化和心力衰竭等都有NO的储备或基础 NO的减少[19]。相关性分析表明，CFs 增殖数目分别与 NO 含量和iNOS活性呈显著负相关[20]。另外，NO是自由基气体，可在许多细胞与组织合成;心肌细胞本身含有NOS，可催化L精氨酸(Larginine，LArg)合成NO，NO可抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大反应。但是NO在心脏CFs增殖中的作用及其细胞内信号转导通路尚未完全清楚。本实验观察到，预先给予NO前体LArg可明显抑制AngⅡ所致的心脏CFs胶原合成增加作用，而LArg对正常生长的心脏CFs无明显影响;LArg抑制AngⅡ的效应可被预先给予NOS抑制剂LNAME所阻断;LNAME本身对心脏CFs胶原含量无明显影响，但可明显增强AngⅡ增加心脏CFs胶原含量的作用。以上结果提示，AngⅡ增加新生大鼠心脏CFs胶原含量的过程中，存在LArgNO通路功能相对不足，增加该通路NO的合成可以抑制AngⅡ的效应。然而，NO抑制AngⅡ增加心脏CFs胶原含量的作用是通过什么途径实现的，细胞内信号转导途径如何，有待进一步探讨。

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