【摘要】 目的：了解乳腺浸润性导管癌对不同化疗方案的敏感性及与耐药基因蛋白表达的关系。方法：用免疫组化法检测同一乳腺癌病例新辅助化疗前后耐药基因蛋白谷胱甘肽-S转移酶(GST-π)、拓扑异构酶Ⅱ(ToPoⅡ)、热休克蛋白(HSP)和P-糖蛋白(P-gp)的表达情况，并与3种化疗方案，即环磷酰胺+阿霉素+5-氟尿嘧啶(CAF)、环磷酰胺+氨甲喋呤+5-氟尿嘧啶(CMF)、紫杉醇+阿霉素(TA)方案作相关性分析。结果：CAF方案对乳腺浸润性导管癌耐药表型影响最大，该组28例中11例GST-π由阴性转为阳性表达，7例化疗后ToPoⅡ表达转阴，化疗前后差异显著(P&<0.05);CMF方案31例中，GST-π 5例由阴性转为阳性表达，5例化疗后ToPoⅡ表达转阴;TA方案对乳腺癌耐药表型影响最小，但该方案24例有8例经化疗后P-gp由阳性转为阴性表达。结论：乳腺浸润性导管癌耐药基因表达受不同化疗方案的影响。
【关键词】 乳腺癌;药物耐受性;基因
[ABSTRACT] Objective: To understand the sensitivity of breast invasive ductal carcinoma to different chemotherapy plan and the relationship between the sensitivity and the expression of resistance gene. Methods: Collecting 83 fresh biopsy specimens of breast cancer， observed the expression of GST-π， ToPoⅡ， HSP and P-gp of the same case before and after the chemotherapy， and made the correlation analysis of the expression and three chemotherapy plans such as CAF， CMF and TA plan. Results: The effect of CAF plan to the expression of resistance gene of breast invasive ductal carcinoma was the most important. In this group which having 28 cases the expression of GST-π of 11 cases changed from negative to positive， the expression of ToPoⅡof 7 cases changed from positive to negative after the chemotherapy and there is significant difference before and after the chemotherapy was significant(P&<0.05). In CMF plan group which having 28 cases the expression of GST-π of 5 cases changed from negative to positive， the expression of ToPoⅡof 5 cases changed from positive to negative after the chemotherapy. TA plan affect the expression of resistance gene of breast invasive ductal carcinoma minimally， but in this group which having 24 cases the expression of P-gp of 8 cases changed from positive to negative. Conclusion: Different chemotherapy plan can affect the expression of resistance gene of breast invasive ductal carcinoma.
[KEY WORDS] breast carcinoma; drug resistance; gene
化疗是乳腺癌综合治疗的重要手段，但肿瘤的耐药常导致化疗失败，为避免化疗的盲目性，有必要探索癌细胞对化疗耐药的更深层原因。本文选取乳腺癌发病率最高的浸润性导管癌83例，比较同一患者新辅助化疗前后乳腺癌耐药基因谷胱甘肽S-转移酶(GST-π)、拓扑异构酶Ⅱ(ToPoⅡ)、热休克蛋白(HSP)和P-糖蛋白(P-gp)的表达变化，以探讨不同化疗方案对耐药基因表达的影响。
1 材料和方法
1.1 材料
收集河北北方学院附属第一医院2007～2008年行乳腺癌活检患者标本113例，选取经病理证实为浸润性导管癌83例作为研究对象。患者活检后均行乳腺癌新辅助化疗及改良根治或保乳手术。化疗方案分别为环磷酰胺+阿霉素+5-氟尿嘧啶(CAF)、环磷酰胺+氨甲喋呤+5-氟尿嘧啶(CMF)、紫杉醇+阿霉素(TA)，各1～3个疗程。所有病例按化疗方案分成3组，即CAF组、CMF组、A组。活检及手术标本均经甲醛固定，石蜡包埋，连续制成4μm厚切片，分别进行HE染色和免疫组化染色。
1.2 方法
采用免疫组化染色SP法，鼠抗人P-gp单克隆抗体，兔抗人GST-π单克隆抗体，鼠抗人ToPoⅡ单克隆抗体，鼠抗人HSP多克隆抗体均为美国Zymed公司产品，S-P试剂盒由福州迈新生物技术开发公司提供。操作步骤严格按照说明书进行，用PBS代替一抗作阴性对照，用已知阳性直肠癌组织作阳性对照。
1.3 结果判断
HSP以细胞浆或细胞核出现棕黄色颗粒为阳性细胞。P-gp和GST-π主要根据其分布范围和显色程度，即阳性细胞数比例分为4级。阴性(-)：无棕色反应，细胞背景一致不着色或阳性细胞数小于5%;弱阳性(+)：5%～25%的癌细胞胞浆着棕黄色;中阳性(++)：25%～50%癌细胞胞浆着棕黄色;强阳性(+++)50%以上的癌细胞胞浆着深棕色。ToPoⅡ主要根据其分布范围即阳性细胞数比例分为4级，阴性(-)：细胞核无棕色反应或阳性细胞数小于1%;弱阳性(+)：1%～25%的癌细胞胞核着棕黄色;中阳性(++)：25%～50%的癌细胞胞核着棕黄色;强阳性(+++)：50%以上的癌细胞胞核着棕黄色。
1.4 统计学处理
采用χ2检验，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 GST-π的表达
GST-π表达于胞浆，部分病例阳性细胞分布不均匀(图1A、B)，经化疗后CAF组11例GST-π转阳，化疗前后差异有统计学意义(P&<0.05)，CMF组31例5例由阴性转为弥漫性阳性表达，TA组4例转阴，但化疗前后差异无统计学意义(P&>0.05)(表1)。
2.2 ToPoⅡ的表达
ToPoⅡ表达于细胞核，阳性细胞分布均匀(图2A、B)。化疗后CAF组有7例转阴，化疗前后差异有统计学意义(P&<0.05)，而CMF组31例有5例转阴，TA组有1例转为阳性表达，但化疗前后差异无统计学意义(P&>0.05)(表1)。
2.3 HSP的表达
HSP细胞浆中呈棕黄色为阳性(图3A、B)。CAF组有5例转阳，CMF组13例阳性中有2例转阴，化疗后TA组24例有3例转阳，但化疗前后差异无统计学意义(P&>0.05)(表1)。
2.4 P-gp的表达
P-gp表达于细胞膜和细胞浆，不同病例细胞着色深浅不一(图4A、B)。TA组24例，8例由阳性转为阴性表达，化疗前后差异有统计学意义(P&<0.05)。在CMF组转阴2例，CAF组有5例转阳，但化疗前后自身对照表达的差异无统计学意义(P&>0.05)(表1)。 表1 不同化疗方案化疗前后各基因蛋白表达结果对照 图3 A:CMF方案化疗前HSP表达为阳性，定位于胞浆(Envision100)
3 讨论
化疗在乳腺癌的综合治疗中占有重要地位，手术前后应用全身性化疗以杀灭亚临床型转移灶是提高治疗效果和生存率较为成熟的方法。而化疗成功的主要障碍是癌细胞对化疗药物产生耐药性[1]，越来越多的研究发现乳腺癌耐药为多基因、多步骤耐药，涉及P-gp、GST-π、HSP、ToPoⅡ等[24]。本实验检测同一乳腺癌病例化疗前后耐药基因的表达情况，并作自身对照研究，探讨了CAF方案，CMF方案、TA方案对耐药基因P-gp、GST-π、HSP、ToPoⅡ表达的影响，了解化疗是否能克服耐药问题，结果提示化疗可以诱导乳腺癌耐药基因表达的改变。
GST-π是GST家族中的一种主要同工酶，具有解毒作用，能催化谷胱甘肽和各种亲电子化合物结合，其可减弱化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用，从而造成癌细胞耐药，其高表达对化疗耐药有重要影响[5]。Kim等[6]用免疫组化法检测乳腺癌化疗组与未化疗组的GST-π表达情况，发现化疗对GST-π表达无影响。但未做化疗前后GST-π表达差异的自身对照研究，也未考虑化疗方案选择对实验结果的影响。本实验中化疗前后自身对照研究表明以CAF方案做化疗可使部分GST-π阴性的乳腺癌变为阳性表达，化疗前后差异显著，提示乳腺癌组织中GST-π可能参与化疗的获得性耐药。
TopoⅡ在DNA复制、转录和染色体分离中起重要作用，是催化DNA拓扑状态相互转换的一种蛋白酶，是多种化疗药物的作用靶点。它是多种抗癌药物如托扑异构酶抑制剂作用的靶酶，不同的表达量和活性与耐药表性的维持密切相关，表达水平下降则肿瘤对抗癌药物敏感性下降，耐药性增加[7]。关于乳腺癌化疗对ToPoⅡ活性的影响国内外报道较少。有人将乳腺癌化疗前后病例进行比较后发现，两组间表达差异不明显，认为短期的化疗不足以引起ToPoⅡ活性变化[8]。本实验研究结果表明方案为CAF化疗可使部分乳腺癌病例出现ToPoⅡ表达的明显下降，而CMF组和TA组也有少量病例化疗前后ToPoⅡ表达出现变化，但差异不明显。
HSP是细胞受应激源刺激后诱导产生的一组应激蛋白，与肿瘤发生、增殖及分化有关，按其分子量不同可分为3种不同类型，其中HSP70与恶性肿瘤关系密切，参与控制肿瘤细胞的增殖和凋亡，在肿瘤发生发展中充当分子伴侣。防止异常蛋白积聚而产生异常折叠，维持细胞的自稳态，使细胞维持增生状态免于凋亡。对HSP的转基因研究表明，它与多Y药耐药(MDR)机制有关。热休克蛋白可能参与调节细胞对化疗药的敏感性[9]。本实验结果说明，CAF方案可使部分乳腺癌病例不同程度出现HSP表达升高，值得进一步研究。
P-gp糖蛋白是一种多要耐药基因(MDR1)编码的能量依赖性转运蛋白，分子量为170 kD。其耐药机制是将肿瘤细胞内的化疗药物泵出细胞外，从而使细胞内药物浓度降低，产生耐药性[10，11]。Verrelle等认为乳腺癌的P-gp阳性细胞数量和染色强度与化疗效果和病人预后呈负相关。Botti等发现P-gp高表达的乳腺癌病人化疗效果差，容易发生转移，相反，低表达者化疗效果好，预后好。本研究发现，P-gp在化疗前乳腺癌组织中有一定表达，说明其在乳腺癌原发耐药中亦有重要作用。以CAF、CMF方案做化疗，大多数病例化疗前后P-gp表达无明显变化。而TA方案化疗组部分化疗前阳性的病例化疗后转阴，表明TA方案可能使部分乳腺癌P-gp表达下调。
由此可见，新辅助化疗可使乳腺浸润性导管癌耐药基因表达发生变化，不同化疗方案对耐药基因表达影响不一致。TA方案较少使乳腺癌的耐药表型增加，甚至有使P-gp表达水平下调的趋势。CAF方案对耐药表型影响最大，可使GST-π和ToPoⅡ表达出现明显变化，使乳腺癌耐药性增加。临床医生如果化疗前检测患者耐药基因表达情况，为选择更加合理的个性化化疗方案提供参考依据，以提高治疗效果和延长患者生存期。
参考文献
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