丹参对大鼠肺缺血再灌注损伤保护作用的研究

　　　　　　 作者：程键，程青，杨剑虹，陆卫华

【摘要】 目的： 探讨丹参对大鼠肺缺血再灌注损伤的保护作用并探讨其机制。方法：60只Wistar大鼠随机分为3组：手术对照组(A)，缺血再灌注组(B)，丹参干预组(C)。每组分别于缺血第45 min、再灌注30 、60、120 min，观察肺组织病理形态变化，检测血浆丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的含量，测定肺组织湿/干重(W/D)比值，TUNEL法测定肺组织中细胞凋亡指数(AI)。结果:(1)肺组织病理变化：B组肺组织毛细血管充血、水肿、炎性细胞浸润显著，C组肺组织较B组减轻;(2)血浆MDA、SOD含量：经缺血再灌注后，B和C组血浆MDA较A组均明显增加(P&<0.05)，B组增加的程度明显高于C组(P&<0.05);B和C组血浆SOD较A组同时点均显著下降(P&<0.05)，C组减少的程度明显小于B组(P&<0.05);(3)肺组织W/D 比值：经缺血再灌注后，B组和C组的肺组织W/D比值都呈进行性上升(再灌注60，120 min vs缺血45 min，P&<0.05);C组上升幅度明显小于B组(再灌注60，120 min时，C组vsB组，P&<0.05);(4)肺组织细胞AI的变化：B组及C组缺血再灌注后均可见肺组织细胞凋亡现象，但与B组相比，C组相同时点的肺组织细胞凋亡数显著减少(P&<0.05)。结论:丹参对于实验性大鼠肺缺血再灌注损伤具有一定的保护作用，其作用机制与清除氧自由基、抗氧化及抗细胞凋亡有关。

【关键词】 丹参;再灌注损伤;肺缺血;大鼠

　　　　A study of the protective effects of radix salviae miltiorrhizae on ischemiareperfusion injury in rat lungCHENG Jian， CHENG Qing， YANG Jianhong， LU Weihua(Department of Emergency， General Hospital of Guangzhou Military Area in Wuhan， Wuhan 430070， China)[ABSTRACT] Objective: To study the mechanism of the protective effects of radix salvia miltiorrhiza on lung ischemiareperfusion injury.Methods: Sixty Wistar rats were randomly pided into three groups: surgical control group (group A)，ischemiareperfusion group (group B) and Radix salvia miltiorrhiza group (group C).In each group， 5 rats were sacrificed at one of four time points(45 min after ischemia;30 min，60 min and 120 min after reperfusion).The concentration of malondialdehyde(MDA)and superoxide dismutase(SOD)in plasma were detected，and the lung tissue wet/dry (W/D) ratio were examined.The histology of lung was observed，and the apoptotic index (AI) was detected by deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP nick end labeling (TUNEL).Results: (1).Histological changes：Marked pulmonary capillary congestion，edema and infiltration were observed in group B， while less pathologic alterations were shown in group C. (2).The concentration of MDA in plasma of both group B and C were significant higher at each time point after ischemiareperfusion than that of group A (P&<0.05). Between group B and C， the increased level of the former group was obviously higher than the latter one (P&<0.05); The concentration of SOD in plasma of group B and C were significantly lower at each time point than that of group A(P&<0.05)，and the decreased level of group C was obviously lower than that of group B (P&<0.05). (3)The W/D ratio of lung tissue in group B and C increased progressively with time after reperfusion (60 min， 120 min reperfusion vs 45 min ischemia，P&<0.05);but the increase degree of group C was obviously lower than that of group B (at 60 min， 120 min after reperfusion， group C vs group B，P&<0.05).(4). The AI of lung tissue were observed in both group B and group C， but AI in group C at different time points after reperfusion were all significant less than that in group B (P&<0.05).Conclusion: radix salvia miltiorrhiza can effectively protect Wistar rats from ischemiareperfusion lung injury and the mechanism is involved with its function of oxyradical elimination，antioxygen and antiapoptosis.

　　[KEY WORDS] Radix salvia miltiorrhiza; Reperfusion injury; Lung ischemia;Wistar rats

　　近年来，随着心脏手术、器官移植、心肺脑复苏措施的深入开展，体外循环技术在临床上的应用日益增多，对肺缺血/再灌注(lung ischemiareperfusioniniury， LIRI)损伤，及其所导致的肺功能障碍的发生和防治也逐渐被人们重视。LIRI的确切发病机制尚未完全明了，目前认为与氧化损伤、钙超载、中性粒细胞引起的过度炎症反应及细胞凋亡等有关。众多实验研究表明，中药能较好地抗LIRI，具有良好的应用前景，其中，丹参尤为受到广泛关注。本实验旨在通过建立大鼠在体LIRI模型，在缺血再灌注之前给予丹参，研究丹参对LIRI是否具有保护作用及其作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物与试剂

　　健康雄性Wistar大鼠60只，体重(200±50) g，由华中科技大学同济医学院动物中心中提供。丹参注射液由四川升和制药有限公司生产，国药准字Z51021303。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)检测试剂盒均购置于南京建成生物工程公司;细胞凋亡检测试剂盒(POD)购置于武汉博士德生物工程公司。

　　1.2 动物模型制备

　　健康Wistar大鼠，3%戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉后，尾静脉注射肝素(100 U/kg)。气管切开后进行气管插管，小动物呼吸机辅助通气。胸骨右缘第四肋间开胸，结扎右主支气管和右肺动静脉。并应用温热的37 ℃的生理盐水棉纱敷盖创口。缺血的时间为45 min，为缺血期。45 min后放开结扎线，使肺脏充盈后，计时120 min，为再灌注期。再灌注期结束后左房放血处死大鼠。

　　1.3 动物分组及处理

　　60只大鼠随机分成3组，每组20只。(1)手术对照组(A组)：预先给予生理盐水0.5 mL/kg腹腔内注射，开胸游离右肺门后，不行夹闭阻断;(2)缺血再灌注组(B组)：预先给予生理盐水0.5 mL/kg腹腔内注射，开胸游离右肺门后，夹闭阻断45 min，继行再灌注;(3)丹参干预组(C组)：预先丹参5 g/kg腹腔内注射，余操作同B组。各组分别于夹闭缺血45 min、再灌注后30，60，120 min 4个时间点左房放血处死5只大鼠，留取标本。

　　1.4 观察指标及方法

　　1.4.1 病理检查 取右肺组织少许经10%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋、切片，HE染色后光学显微镜观察。

　　1.4.2 血浆SOD、MDA测定 采用黄嘌呤氧化酶法测血浆超氧化物歧化酶(SOD)活性;硫代巴比妥酸法测丙二醛(MDA)活性。

　　 1.4.3 肺组织W/D比值 用滤纸吸去右肺上叶血，称湿重后，置烤箱中(80 ℃，20 h)烤至恒重，称干重，计算肺W/D比值。

　　1.4.4 肺组织细胞凋亡指数(AI) 取小块肺组织用10%甲醛固定，常规石蜡包埋，采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL )对右肺中叶凋亡细胞进行定量检测，按细胞凋亡检测试剂盒说明书操作。阳性细胞表现为细胞核呈棕黄色着染，每张切片光镜(40×10倍)观察随机选择的10个视野，计算细胞中的平均阳性细胞百分数为凋亡指数(apopotosis index， AI) 。

　　1.5 统计学处理

　　实验数据以均数±标准差(±s )表示，应用SPSS12.0统计软件进行方差分析和t检验处理，P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 病理组织学改变

　　光镜下B组肺组织损伤随再灌注时间进行性加重，毛细血管充血、肺泡间隔炎性细胞浸润明显，肺泡腔内大量炎性渗出、出血;而C组除肺泡间隔炎性细胞浸润有所增多，肺泡腔内少量红细胞及炎性细胞，未见出血。

　　2.2 肺组织W/D比值

　　经缺血后，两组大鼠肺组织W/D比值变化不显著;再灌注后，B组肺组织W/D比值呈进行性上升，于再灌注的第120 min升至最高(再灌注60、120 min vs缺血45 min，P&<0.05);C组肺组织W/D比值虽也有上升趋势，但上升幅度明显小于B组(再灌注60，120 min时，C组vs B组，P&<0.05)(表1)。

　　2.3 血浆SOD、MDA活性

　　B组经缺血再灌注后，血浆SOD含量较A组同时点均显著下降(P&<0.05);C组血浆SOD含量低于A组(P&<0.05)，但减少的程度明显小于B组(P&<0.05)。B组在缺血再灌注后血浆MDA含量较A组同时点均明显增加(P&<0.05);C组血浆MDA含量高于A组(P&<0.05)，但增加的程度明显小于B组(P&<0.05)(表1)。

　　2.4 肺组织细胞凋亡指数(AI)

　　A组未见明显凋亡细胞;B组及C组缺血后再灌注30，60，120 min均可见肺组织细胞凋亡现象，但与B组相比，C组相同时点的AI显著减少(P&<0.05);肺组织细胞凋亡的分析均还发现，两组中120 min组凋亡细胞数均明显高于30min、60 min组(P&<0.05) (见表1)。表1 各组缺血前、后不同时点W/D、SOD、MDA、AI比较注：*与45 min缺血比较P&<0.05;#与再灌注120 min比较P&<0.05;a与同时间点A组比较P&<0.05，b与同时间点B组比较P&<0.05。

　　3 讨论

　　肺缺血再灌注损伤(LIRI)，一个包括多种细胞释放出的活性氧自由基( reactive oxygen species，ROS)增加的、复杂的级联反应事件[1]。ROS在肺缺血再灌注损伤中起主要作用，以引起组织的脂质过氧化损伤，并释放弹性蛋白酶、溶酶体酶等损伤和破坏肺组织结构导致肺水肿。W/D增高可反映肺微血管通透性增高，SOD活力的高低间接反应了机体消除氧自由基的能力，而MDA的高低又间接反应了机体细胞受自由基攻击的严重程度。

　　本文实验在阻断右肺门缺血45 min后，开放肺门，再灌注30，60及120 min，从病理切片上观察到缺血45 min后即出现毛细血管充血，肺泡间隔炎性细胞浸润，且随着再灌注时间的延长，肺组织的损伤进行性加重，肺泡腔内大量炎性细胞渗出、出血及炎性渗液积聚。这些病理变化特点与文献报道的急性肺缺血再灌注损伤早期病理形态改变相一致[26]。

　　丹参在缺血/再灌注损伤作用包括：(1)抑制炎症细胞的趋化、浸润、聚集、活化。有研究显示，丹参可通过下调白细胞CD11/CD18，细胞间粘附分子(ICAM)的表达，减少白细胞粘附聚集于缺血组织，进而显著减轻IRI的发生[7];(2)抑制呼吸爆发;(3)改善能量代谢;(4)清除自由基：丹参的保护作用可能是打破氧自由基介导的细胞损害、发病机制的恶性循环，抑制脂质过氧化物的形成，抑制自由基介导的细胞损害作用，保护细胞膜结构和功能的完整性[8];(5)减轻钙超载：丹参作为一种钙拮抗剂，可通过降低膜通透性、阻断细胞膜钙通道、阻断细胞内钙库钙释放通道、提高细胞色素p450或促进细胞色素p450依赖性混合功能氧化酶合成来减轻钙超载;(6)抗凋亡作用;(7)影响热休克蛋白表达;(8)改善血液流变学及微循环状况[911]。

　　我们在实验中观察到B组在灌注后肺组织损伤随再灌注时间进行性加重，毛细血管充血、肺泡间隔炎性细胞浸润明显，血浆SOD含量进行性下降，而同时MDA含量却显著升高，W/D进行性上升，过度凋亡，而使用丹参干预后C组在灌注后肺组织损伤减轻，血浆SOD活性显著升高，MDA含量显著降低，W/D大大降低，细胞凋亡减少。这与上述研究的结果相似。如果能将血清丹参调控到适当浓度，使其能充分发挥抗氧化保护作用，对于临床具有不可低估的意义，这还有待于进一步探讨。

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