心肌梗死患者外周血单个核细胞基质金属蛋白酶9mRNA的表达

【摘要】 目的：探讨单个核细胞(PBMC)中基质金属蛋白酶9(MMP9)在心肌梗死(AMI)病理生理机制中的作用。方法:用电化学发光法检测30例AMI患者与对照组30例血浆肌钙蛋白T(cTnT)的含量;用ELISA法测定血浆MMP9的含量及RTPCR检测单个核细胞中MMP9mRNA的表达水平。结果: AMI患者在6 h及1周内MMP9的含量分别为(697±143 ) ng/mL，(597±102 ) ng/mL较对照组的(342±165 ) ng/mL显著增高(P&<0.05)，与cTnT的变化差异无统计学意义(P&>0.05)，且呈正相关(r=0.82， P&<0.05)。AMI患者单个核细胞MMP9mRNA表达显著增强。结论: AMI患者PBMC处于炎性状态，MMP9mRNA表达增强，并可能由此导致血浆MMP9水平增高。监测血浆MMP9 的水平有可能成为了解AMI发生发展的一个重要诊断指标，为AMI的治疗和预后提供临床依据。

【关键词】 心肌梗死; 基质金属蛋白酶9; 单个核细胞; 肌钙蛋白T

　　 Matrix metalloproteinase9 mRNA expression of peripheral blood mononuclearcell in patients with acute myocardial infarctionRONG Hong1， SANG Shenggang2(1.Department of Stomatology; 2. Clinical Laborary Department， Affiliated Hospital of Hainan Medical College， Haikou 570102， China)[ABSTRACT] Objective: To investigate the role of matrix metalloproteinase9 (MMP9) in the development of acute myocardial infarction (AMI). Methods: The plasma troponin T of both 30 acute myocardial infarctions and 30 control cases were measured by automatic electrochemiluminescence analysis; plasma MMP9 levels were quantified with enzymeimmunoassay method (ELISA); and mRNA expression of MMP9 extracted from mononuclearcell were detected by RTPCR method. Results: MMP9 levels of the AMI group within 6 h and during the first week were (697±143) ng/mL and (597±102) ng/mL separately， both of which were significant higher than (342±165 ) ng/mL of the control group (P&<0.05). There was a positive correlation between the levels of MMP9 and cTnT (r=0.82， P&<0.05) though no significant difference was found. The MMP9 mRNA expressions were obviously amplified in peripheral blood mononuclearcells. Conclusion: The study demonstrats that the concentration and expression of MMP9 mRNA are significant higher in patients with myocardial infarction than that in control group. The activated peripheral blood mononuclear cells and enhanced MMP9 mRNA expression may result in the increase of the MMP9 concentration in plasma of the patient. Thereby， the MMP9 level of plasma can be valued as an important index for the diagnosis， treatment and prognosis of acute myocardial infarction.

　　[KEY WORDS] Matrix metalloproteinase9; Acute myocardial infarction; Mononuclearcell; Troponin T

　　心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是严重危害人类健康的疾病，冠状动脉粥样硬化斑块破裂与触发血栓形成是导致AMI的一个重要机制[1]。基质金属蛋白酶9(matrix metal Oproteinase9，MMP9) 是引起斑块破裂的主要内在因素之一。AMI患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclearcell， PBMC)处于炎性状态，PBMC在病灶组织内皮下的浸润、聚集，是动脉粥样硬化及AMI等疾病发生的早期重要环节。有研究表明[2] ，在粥样硬化斑块及AMI组织，浸润的PBMC大量表达MMP9，MMP9能特异性地与细胞外基质相结合、降解细胞外基质，导致斑块不稳定，易形成血栓，发生AMI，并加重继发性心肌损害。本文采用细胞培养及分子生物学技术，检测2007年10月～2008年12月海南医学院附属医院心内科AMI30例患者单个核细胞MMP9表达水平的变化，探讨单个核细胞MMP9在AMI病理生理机制中的临床意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 仪器与试剂

　　全自动电发光分析仪(HITACHI Elecsys2010)，cTnT(Roche)，MMP9(上海森雄科技实业有限公司)， 自动酶标仪(美国宝特ELx800型)，自动洗板机(芬兰Lab systems D ragon )，pUC Mix Marker(上海生物工程公司)，MMP9 引物、βactin引物(大连宝生物有限公司)，GeneAmP PCR System 2400(美国PERKIN ELMER)，TGL16WS台式高速离心机(长沙湘仪礼离心机仪器有限公司)，电泳仪(北京市六一仪器厂DYY7B型)，凝胶成像系统(德国 Herolab UVT28)。

　　1.2 资料来源

　　本组AMI患者30例，男性18例，女性12例，平均年龄(58.6±7.5)岁，全部符合临床诊断标准[3]。心肌梗死部位包括前壁梗死13例，间壁梗死10例，下壁梗死5例，侧壁梗死2例。对照组来自同期海南医学院附属医院体检中心体检者30例，男性19例，女性11例，平均年龄(56.4±5.2)岁。所有对象应排除急慢性感染性疾病、肝病、脑血管疾病、高血压、高脂血症、肾病、糖尿病及其他自身免疫性疾病。AMI患者分别在6 h内、治疗1周内、临出院时静脉采血，正常对照组采空腹血1次，均分2管，1管用于PBMC分离培养，1管用于cTnT、MMP9的测定。

　　1.3 实验方法

　　(1) PBMC的分离(Ficoll法):无菌抽取静脉血2ml，去掉针头注人含有肝素的无菌试管中摇匀，先作白细胞计数，然后加入2 mL Hanks(或PBS)溶液进行对倍稀释，混匀。用吸管吸取稀释血液沿试管壁缓缓加到含有2 mL淋巴细胞分离液的试管中[血液∶Hanks(PBS)液∶淋巴细胞分离液的比例为1∶1∶1]，沿管壁流下的稀释血液叠加在分离液之上，并与分离液形成明显的界面。 经水平式离心2 000 r/min×20 min，小心取出试管。用平口吸管小心吸取中层呈白色雾状的淋巴细胞层，用Hanks(PBS)溶液洗涤两次，每次离心1 500 r/min×10 min。弃上清，加RPMI1640培养液1 mL混匀，取少许进行细胞计数及活力测定。将淋巴细胞悬液用RPMI1640培养液配成相应的细胞浓度备用。

　　(2)PBMC培养：细胞均置于含有10% FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL 链霉素的含5%小牛血清的RPMI1640培养液中于37 ℃，5%CO2 培养箱中培养7 d，收集PBMC进行RTPCR，测定MMP9mRNA的表达。

　　1.4 单个核细胞MMP9mRNA逆转录聚合酶链反应测定(RTPCR)

　　(1)MMP9 引物设计：上游5'AGA CCT GAG AAC CAA TCT CAC3'，下游 5'GGC ACT GAG GAA TGA TCT AA3';βactin引物设计：上游 5'ATC TGG CAC CAC ACC TTC TAC AAT GAG CTG CG3'，下游 5'CGT CAT ACT CCT GCT TGC TGA TCC ACA TCT GC3'。(2)MMP9RNA提取及RTPCR操作严格按照试剂操作说明进行。(3)RTPCR鉴定及电泳分析：取MMP9 RTPCR 扩增产物10 μL，溴酚蓝上样缓冲液2 μL，于1.5%琼脂糖凝胶电泳(含0.5 mg/L 溴化乙锭)，紫外灯下观察，凝胶成像分析系统分析结果、摄像。

　　1.5 统计学处理

　　数据用SPSS11.5统计软件处理，采用(±s)表示，两组间计量资料均数差异显著性比较用student t检验，以P&<0.05为差异有统计学意义，有关指标作直线相关分析。

　　2. 结果

　　2.1 AMI患者肌钙蛋白、MMP9含量变化

　　AMI患者在6 h内肌钙蛋白、MMP9的含量均显著增高，随着治疗好转而下降;与对照组相比，血浆肌钙蛋白、MMP9在6 h内、1周内均显著增高，差异均有统计学意义(P&<0.05);而在恢复期则显著降低，与正常对照组相比无统计学意义(P&>0.05)。MMP9的含量变化与肌钙蛋白相比无显著性差异(P&>0.05)并呈现正相关关系(r=0.82， P&<0.05) (表1)。表1 AMI组及对照组间肌钙蛋白、MMP9比较注：▲、★VS对照组P&<0.05，▲VS★ P&>0.05。

　　2.2 AMI患者血清MMP9mRNA的表达

　　用RTPCR测定AMI患者及对照组MMP9 mRNA的表达。经凝胶成像系统分析，MMP9mRNA在6 h的A值为4 759，1周内A值为4 258，恢复期A值为2 846，对照组A值2 651，βactin的A值为3 468。AMI患者单个核细胞MMP9mRNA的表达在6 h内MMP9/βactin及1周内比值均显著增强，分别达1.37(4 759/3 468)和1.23 (4 258/3 468)，与对照组0.76(2 651/3 468)相比差异有统计学意义(P&<0.05)。恢复期则显著降低0.82 (2 846/3 468)，与对照组相比差异无统计学意义(P&>0.05)。

　　3 讨论

　　基质金属蛋白酶(MMPs) 是酶活性依赖锌离子的蛋白酶超家族，目前已发现的MMPs 家族成员有20多种，根据其底物的特异性和结构的差异分为四大类：胶原酶，明胶酶，基质水解酶，膜型MMPs。MMP9 是明胶酶中的一种，是MMPs中最常见的酶之一，参与了血管的再生、炎症反应等病理过程[4]。近年研究表明，MMP9 的表达及活性增强参与了AMI的发生及左室重塑[5]。

　　本实验研究了AMI发生发展过程中MMP9含量变化及MMP9 mRNA表达情况。循环血液中的PBMC与内皮细胞黏附，在血管壁中迁移、吞噬脂质衍化为巨噬泡沫细胞的过程中可分泌大量的MMP9。病理研究显示MMP9 是一种影响粥样斑块不稳定的主要的基质金属蛋白酶[6]，在AMI中6 h内MMP9即有显著增高，1周内虽有所下降，但仍高于对照组，表明MMP9在AMI早期就有大量释放，并随病情的好转而降低，与 Etoh[7]的报道相一致。本研究显示MMP9在AMI的发生、发展中的变化规律与cTnT相一致，呈良好的正相关关系。目前cTnT是公认的诊断AMI的酶学指标，进一步说明MMP9在AMI的发生发展中起着极其重要的作用。Kalela 等[8]观察血浆MMP9 水平与冠状动脉造影结果，提出MMP9 与病情呈正相关，MMP9 水平越高，狭窄越严重，提示血浆MMP9 可以作为动脉粥样硬化及AMI等病情活跃的标志物，并可作为随访指标。动脉粥样硬化是全身性的系统疾病，不是局部孤立的病灶，血浆MMP9 可来源于粥样斑块内的合成分泌，亦可能来源于循环血液中的PBMC[9]，结合本研究结果，AMI患者PBMC表达MMP9mRNA，并可由此导致血浆MMP9 水平增高。

　　MMP9 参与动脉粥样硬化及AMI的病理过程，使粥样斑块易脱落，形成血栓，并在AMI发生后，使炎性细胞由血循环浸入缺血心肌组织，加重了继发性心肌损伤及之后的心肌重塑。在AMI患者，血浆MMP9 可来源于PBMC。因此，在AMI预防和治疗中，抑制MMP9mRNA的表达，应该成为新的靶点及重要的有效途径。快速检测血浆中MMP9的含量有可能成为AMI诊断的指标之一。

参考文献

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　　3 叶任高，陆再英.内科学[M].第6版.北京:人民卫生出版社，2004.290291.

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　　7 Etoh T， Joffs C， Deschamps AI， et al. Myocardial and interstitial matrix metallo2proteinase acitvity after acute myocardial infarction in pigs [J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol ， 2001，281(3):987994.

　　8 Kalela A， Koivu TA， Sisto T， et al . Serum matrix metalloproteinase9 concentration in angiographically assessed coronary artery disease[J]. Scand J Clin Lab Invest，2002，62:337342.

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