脂质体法pcDNA3ELAC2质粒转染乳腺癌细胞MCF7和

　　　　　　作者：宁萍，樊赛军，焦旸，徐加英，胡旭东，朱巍

【摘要】 　　目的：构建稳定、高效表达ELAC2基因的乳腺癌细胞模型MCF7/ ELAC2、 MDAMB231/ ELAC2，以及前列腺癌细胞模型Du145/ ELAC2，为探索ELAC2基因的生物学功能奠定实验基础。方法:将构建pcDNA3ELAC2的质粒采用脂质体法转染乳腺癌细胞和前列腺癌细胞，用 RTPCR和Western Blot分别检测ELAC2基因在细胞中的mRNA表达和蛋白表达。结果: pcDNA3ELAC2质粒构建成功并顺利导入乳腺癌细胞和前列腺癌细胞中，且检测到ELAC2基因的mRNA和蛋白高表达。结论: 构建的pcDNA3ELAC2重组质粒能够在转染的乳腺癌细胞和前列腺癌细胞中稳定、持续和高效地表达，为进一步研究ELAC2基因的生物学功能提供了理想的实验模型。

【关键词】 脂质体；MCF7；MDAMB231；ELAC2基因；pcDNA3 ；Du145
　　
　　［ABSTRACT］ Objective: To construct the transgenic cell model MCF7/ELAC2， MDAMB231/ ELAC2 and Du145/ ELAC2 that expresses stable high amounts of ELAC2， which set up experimental foundation to study biological function of ELAC2 gene. Methods：The recombinant plasmid pcDNA3ELAC2 was transfected into the breast cancer cell lines and prostate cancer cell lines by using lipofectamine transfection reagent. Then the ELAC2 mRNA and protein were detected by RTPCR and Western blot， respectively. Results： pcDNA3ELAC2 was successfully constructed and transfected into breast cancer cells and prostate cancer cells. RTPCR and Western blot showed that the transfected cells had high ELAC2 expression at both mRNA and protein level. Conclusion： Recombinant plasmid of pcDNA3ELAC2 could have stable， sustainable and efficient expression in the transfected breast cancer cells and prostate cancer cells，which provide an ideal experimental model for further study of the biological function of ELAC2 gene.
　　
　　［KEY WORDS］ Liposome; MCF7; MDAMB231; ELAC2 gene; pcDNA3; Du145

　　ELAC2基因是美国科学家新发现的一种导致家族性前列腺癌的基因，这个基因发生突变将增加男性前列腺癌发病的风险，携带这个基因突变体的人患前列腺的几率是正常人的两倍［13］，但是目前这个基因的生物学功能研究报道不多。研究表明，前列腺癌与乳腺癌有着极其密切的联系，一种基因在前列腺癌的发生和发展中发挥作用，往往这种基因也能促进乳腺癌的发生和发展；反之亦然。流行病学的研究结果也提示，前列腺癌患者亲属中的女性易发生乳腺癌［4］ ；而与遗传性乳腺癌的发生明确相关的基因也能增加前列腺癌的发病危险度［57］ ，前列腺癌和乳腺癌可能有着共同的发病机制。所以，本研究旨在建立ELAC2基因的真核表达载体，并将其转染乳腺癌细胞和前列腺癌细胞，使其稳定表达，为进一步探索ELAC2基因的功能奠定基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 质粒和细胞

　　质粒pcDNA3ELAC2由美国Georgetown大学肿瘤研究中心制备。MCF7、MDAMB231、Du145细胞株购自美国细胞收藏中心(Americal Type Culture Collection，ATCC)，由本实验室培养保存。

　　1.1.2 主要试剂

　　Lipofectamine 2000，Trizol液，逆转录试剂盒均购自invitrogen公司。PCR反应试剂盒购自Promega公司。DMEM，小牛血清购自Gibaco 公司。G418 购自sigma公司。BeyoECLA液和B液荧光检测试剂购自Thermo Scientific公司。考马斯亮兰蛋白检测试剂盒购自Beit Haemek公司。

　　1.1.3 引物

　　PCR 扩增ELAC2基因片断上游引物：5'TCTTCAACTGTGGAGAAGGC3'，下游引物：5'CTGTGTATGGGGATCTGGTA3'，扩增片段长度为300 bp;βactin引物:上游5'GACTACCTCATGAAGATC3'，下游5'GATCCACATCTGCTGGAA3'，扩增片段长度700 bp。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养

　　MCF7、MDAMB231、Du145细胞在含10%小牛血清的DMEM培养液中，置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养。

　　1.2.2 G418浓度筛选试验

　　96孔板内接种MCF7、MDAMB231、Du145细胞，每孔9 ×103 个，用含G418的选择培养基培养， G418浓度设0、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1 000 mg/L等11个浓度梯度，每个梯度6个复孔，每3～5 d换液一次， 10～14 d确定最低致死浓度。

　　1.2.3 pcDNA3  ELAC2基因的转染
　　
　　转染前用胰酶消化细胞并计数， 接种到6孔板中，每孔2×105 个细胞。待细胞汇合度达到70～80%，采用脂质体法于离体状态下，用Lipofectamine 2000试剂将重组质粒pcDNA3 ELAC2转染至MCF7、MDAMB231、Du145细胞中，同时设置阴性对照组，空载体pcDNA3组。基因转染6 h后换成含10 %小牛血清的DMEM培养液培养，24 h后加入含有G418 的10%小牛血清DMEM培养液筛选2周。待长出克隆后，随机挑取单个克隆，继续在G418 抗性培养液中筛选，将筛选转染成功的细胞扩大培养后，收集培养备用。

　　1.2.4 RT PCR 检测转染细胞中ELAC2的MRNA表达

　　使用Trizol抽提细胞总RNA；采用逆转录试剂盒按操作说明将细胞总RNA中的mRNA逆转录成cDNA；用PCR MasterMix进行扩增，扩增条件:94 ℃变性3 min， 然后94 ℃变性1 min， 58 ℃退火1 min、72 ℃延伸90 s， 共34个循环， 再72 ℃反应10 min， 4 ℃终止反应。PCR 产物以2%琼脂糖凝胶电泳检测。

　　1.2.5 Western blot 检测细胞中ELAC2的蛋白表达
　　Western blot检测ELAC2蛋白的表达:将收集的细胞加入冰预冷的细胞裂解液充分裂解2 h， 4 ℃，13 000 rpm离心10 min，吸上清(蛋白样品)，考马斯亮兰蛋白检测试剂盒测定总蛋白含量，取等量蛋白与5 μl的蛋白上样缓冲液混匀，99 ℃加热5 min后上样，SDSPAGE电泳， 硝酸纤维素膜电转膜过夜后，封闭液室温封闭1 h，加入羊单克隆ELAC2抗体(一抗) ，孵育1 h，以PBS Tween 20溶液振摇洗涤3 次，每次15 min，加入二抗，室温孵育1 h，接着再以PBS Tween 20溶液振摇洗涤3次，每次15 min，将膜取出用等体积BeyoECL A液和B液荧光检测试剂处理5 min，于暗室中用胶片曝光、显影、定影成像。

　　2 结果

　　2.1 G418筛选细胞的最低致死浓度

　　采用浓度梯度为0～1 000 mg/L 的G418 培养细胞2周后， MCF7细胞在G418浓度大于600 mg/L 的孔内全部被杀死，而500 mg/L 及以下的孔内尚有活细胞， 故600mg/L为筛选MCF7细胞的最低致死浓度。而当G418浓度低于400 mg/L以下时，MDAMB231、Du145细胞孔内尚有活细胞，浓度超过500 mg/L则全部死亡，故筛选MDAMB231、Du145细胞的浓度为500 mg/L。

　　2.2 脂质体法pcDNA3  ELAC2质粒转染细胞

　　MCF7、MDAMB231、Du145细胞在转染6 h后，细胞浆内出现颗粒。转染24 h后， 加入G418 抗生素进行筛选2周， 此时可以见到空白对照组细胞完全死亡， 转染空载体组和转染ELAC2基因组已形成阳性细胞克隆。

　　2.4 转染前后细胞中ELAC2的mRNA 表达鉴定
　　
　　将收集的MCF7、MCF7/pcDNA3、MCF7/ELAC2；MDAMB231、MDAMB231/pcDNA3、 MDAMB231/ELAC2以及Du145、Du145/pcDNA3、Du145/ELAC2细胞， 分别提取细胞总RNA， 应用RTPCR检测ELAC2基因mRNA表达。结果显示:转染目的基因的细胞中ELAC2基因mRNA 高水平表达，其片段大小为300 bp，与理论值大小相符，而相应的空载体组细胞及未转染的对照组细胞没有ELAC2基因mRNA表达，见图1。转染株MCF7/ELAC2细胞冻存一个月复苏后传5代仍检测到ELAC2基因mRNA表达，见图2。

　　2.5 转染前、后细胞中ELAC2的蛋白表达鉴定
　　
　　将收集的MCF7、MCF7/pcDNA3、MCF7/ ELAC2、MDAMB231、MDAMB231/pcDNA3、 MDAMB231/ ELAC2以及Du145、Du145/ pcDNA3、Du145/ ELAC2细胞，经SDSPAGE电泳，转膜，加一抗二抗显色后，ELAC2基因的蛋白表达水平如图所示。转染株MCF7/ELAC2细胞冻存1个月复苏后传5代仍检测到ELAC2基因蛋白表达，见图3。转染目的基因组中ELAC2蛋白水平明显高于原代细胞组和空载体组，见图4。注：各组中1为未转染的对照细胞，2为转染空载体的细胞，3为转染ELAC2基因的细胞。

　　3 讨论

　　ELAC2基因是2001年由美国科学家Tavtigian新发现的一种导致家族性前列腺癌的易感基因， 位于人类17号染色体长臂［1］。人类ELAC2基因由24个外显子组成，编码由826个氨基酸组成的一种未知蛋白质［8］。 前列腺癌中ELAC2基因发生了移码突变或错义突变。移码突变是在第1641碱基位置插入一个G，使得该基因所表达的蛋白质长度减少了一半，很可能使其生物学功能丧失。错义突变则位于该基因相当保守的区域（Ser217Leu， Ala541Thr， Arg781His）。目前，前列腺癌中ELAC2基因的突变位点、ELAC2基因的突变与前列腺癌的发病相关程度，在国外已经引起大量学者的关注与研究，而对该基因的生物学功能研究报道较少。
　　
　　将目的基因导入特定的靶细胞内， 研究某一特定基因的功能和作用，已成为肿瘤研究的热点。非病毒载体系统具有低毒、低免疫反应、外源基因整合几率低、无基因插入片段大小限制， 易于组装，使用简单，制备方便以及相对靶向等优点，其缺点是效率低且携带基因表达时间短［9］。自应用脂质体包裹生物分子导入细胞以来，有学者已利用脂质体将各种DNA 转入动物细胞，并在受体细胞中得到表达。随着脂质体技术的发展，其毒性作用也逐渐降低，许多脂质体介导外源基因的体内和体外实验均证明，脂质体本身不会对细胞或机体产生明显的毒副作用。因此，本研究采用脂质体法将pcDNA3ELAC2质粒导入乳腺癌细胞株MCF7和MDAMB231以及前列腺细胞株Du145，实验观察到，转染2周后未转染组的对照细胞在含G418的培养液中彻底死亡，而转染空载体和ELAC2基因组的细胞长出克隆。挑取克隆扩增后，通过RTPCR证实转染后细胞ELAC2的mRNA表达水平增加，Western blot证实转染后细胞ELAC2的蛋白表达水平增加，说明ELAC2基因成功转染到乳腺癌细胞MCF7、MDAMB231和前列腺癌细胞Du145中，为进一步研究ELAC2基因的生物学功能奠定了基础。

参考文献

　　1 Tavtigian SV， Simard J， Teng DH， et al. A candidate prostate cancer susceptibility gene at chromosome 17p［J］. Nature Genetics，2001，27:172180.

　　2 Rebbeck TR， Walker AH， ZeiglerJonson C， et al. Association of HPC2/ELAC2 genotypes and prostate cancer［J］. American Journal of Human Genetics，2000，67(4):10141049.

　　3 NoonanWheeler FC， Wu W， Roehl KA， et al. Association of hereditary prostate cancer gene polymorphic variants with sporadic aggressive prostate carcinoma［J］.Prostate， 2006，66(1):4956.

　　4 顾方六. 现代前列腺病学［M］. 北京: 人民军医出版社，2002.284.

　　5 Scully R， Chen J， Ochs RL， et al. Dynamic changes of BRCA1 subnuclear location and phosphorylation state are initiated by DNA damage［J］. Cell，1997，90(3):425435.

　　6 Scully R， Livingston DM. In search of the tumoursuppressor functions of BRCA1 and BRCA2［J］. Nature，2000，408(6811):429432.

　　7 Haber D. BRCA1: an emerging role in the cellular response to DNA damage［J］. Lancet，2000，355(9221):20902091.

　　8 Dumont M. Frank D. Moisan AM， et al. Structure of primate and rodent orthologs of the prostate cancer susceptibility gene ELAC2［J］. Biochimica et Biophysica Acta，2004，1679(3)：230247.

　　9 李立家.基因工程［M］.北京:科学出版社，2003.924.