HLA DRB1 基因多态性与贵州地区汉族人群结核病的易感性分析

【摘要】 目的：探讨HLA DRB1基因多态性与汉族人群结核病的遗传相关性。方法：用聚合酶链反应序列多态性分析(PCRSSP)技术分别对47例贵州地区汉族活动性结核病患者及53例汉族健康对照者进行HLA DRB1等位基因分型。结果：在等位基因HLADRB1中，结核病患者的HLADRB1*16的基因频率明显高于正常对照组(P&<0.05)，而HLADRB1*11基因频率则低于正常对照组(P&<0.05)。结论：HLADRB1*16可能为贵州地区汉族人群结核病的易感基因，HLADRB1*11可能为汉族人群结核病的保护基因。

【关键词】 HLADRB1基因;多态性;易感性;结核病;贵州省

　　 Study on the association of the polymorphisms of HLA DRB1 genes with the susceptibility to tuberculosis in a population of Han nationality in GuizhouWANG Yongxia(Department of Clinical Microbiology and Immunology， Hainan Medical College， Haikou 571101， China)[ABSTRACT] Objective: To determine whether or not the polymorphisms of the HLA DRB1 gene are associated with tuberculosis heredity in Han people. Methods: The polymorphisms of the HLA DRB1 gene were typed by polymerase chain reaction sequence specific primers (PCRSSP) technique among 53 healthy controls and 47 tuberculosis cases of Han people from Guizhou province. Results: The frequency of HLADRB1*16 allele in tuberculosis cases was significant higher than that in healthy controls (P&<0.05)， but frequency of HLADRB1*11 allele was lower than (P&<0.05). Conclusion: The results suggest that HLADRB1*11 allele is closely correlated to the incidence of tuberculosis in this population of Han nationality， while HLADRB1*11 allele may be associated with an antagonist effect in the pathogenesis of pulmonary tuberculosis in this population.

　　[KEY WORDS] Polymorphisms; HLADRB1*11 gene; Susceptibility; Tuberculosis; Guizhou province

　　结核病是由结核分枝杆菌感染引起的严重危害人类健康的全球性传染病。据统计全球每年约300万人死于结核病，成为由单一感染因素引起死亡人数最多的疾病。然而，并非所有感染结核分枝杆菌者都发展成为结核病，据WHO的统计资料，仅有不到1/10的感染者会进一步发展成为临床结核病[1]，这说明结核病的发病不仅与感染有关，还与环境及机体的遗传易感性密切相关。 HLADRB1基因位于人第6对染色体短臂上，是最具多态性的遗传系统，国内外已有其多态性与结核病易感性的相关报道，但不同民族和人群结果不一致。本研究应用聚合酶链反应一序列特异性引物(polymerase chain reaction sequence specific primers， PCRSSP)技术研究贵州地区汉族人群HLADRB1基因多态现象与结核病易感性的相关性，以获得与结核病易感相关的遗传学资料。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象

　　病例组: 病例标本来自于贵阳市结防所经检查确诊为活动性肺结核的汉族患者47例， 男性27例，女性20例，年龄24～59岁，平均年龄32岁，无艾滋病、糖尿病、高血压等合并症。正常对照组: 随机选取无血缘关系的健康汉族人群53例， 男性32例， 女性21例， 年龄23～54岁，平均年龄30岁， 无结核病接触史、结核病史及遗传病史。

　　1.2 试剂

　　DNA 抽提试剂盒购自美国PELFREEZ公司， Taq DNA 聚合酶、dNTP和DNA Marker 购自大连宝生物工程有限公司，HLADRB1 PCRSSP 分型试剂盒购自美国Lambda 公司。

　　1.3 　标本采集

　　静脉采血约2～3 mL ， 用EDTA.Na2 抗凝备用。

　　1.4 　DNA 提取

　　采用DNA 抽提试剂盒严格按说明书操作。提取的DNA 用紫外分光光度计测定浓度和纯度，A 260/280 nm 应在1.6～1.8， DNA浓度在80 ng/μL， 抽提的DNA 于20 ℃保存备用。

　　1.5 　PCRSSP 分析HLA DRB1基因多态性

　　按试剂盒说明操作， 对抽提的DNA 样本进行PCR 扩增。扩增条件: 96 ℃预变性150 s; 96 ℃变性15 s， 65 ℃复性60 s，共10个循环;95 ℃变性15 s， 62 ℃复性50 s，72 ℃延伸30 s， 共22个循环。 取PCR扩增产物于2% 琼脂糖凝胶上100 V 稳压电泳1 h，于凝胶成像仪观察结果， 按试剂盒提供的基因电泳格局图确定基因位点。

　　1.6 统计学处理

　　患者组与正常组之间基因频率差异分析采用χ2 检验， 当1≤T&<5， 但n≥40时， 用连续性校正检验; 当T&<1或n&<40时， 用Fisher精确检验。P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 　PCRSSP 分析HLA DRB1 基因多态性

　　根据各PCR产物是否扩增出目的片段综合判定HLADRB1基因型， 如图1显示该例基因型为HLADRB1* 04/15。

　　2.2 　等位基因HLADRB1基因频率的比较

　　HLA DRB1基因共出现13个位点， 基因频率见表1。在53例正常对照组的HLADRB1等位基因中， DRB1*03、DRB1*08、DRB1*09、 DRB1*11及DRB1*12 等位基因频率较高; 而DRB1*01、DRB1*04 、DRB1*15 及DRB1*16等位基因频率较低。在47例结核病患者的HLADRB1 等位基因中， DRB1*04、DRB1*08、DRB1*09、DRB1*14及DRB1*16等位基因的频率较高;而DRB1*01、DRB1*11及DRB1*12等位基因频率较低。其中DRB1*16等位基因频率明显高于正常对照组(P&<0.05) ; DRB1*11等位基因频率明显低于正常对照组，(P&<0.05) ， 其他差异无统计学意义。表1 病例组与正常对照组HLADRB1等位基因频率分布

　　 3 讨论

　　大量研究表明，结核病的发生不仅与环境因素有关，还与机体的遗传因素密切相关。不同种族人群携带的不同基因可能影响结核病的易感性[2]。HLA复合体作为人体最复杂的基因系统，与结核病的相关性越来越受到研究者的重视，尤其是其中的HLADRB1等位基因更成为研究的重点。但关于HLADRB1等位基因与结核病易感性的相关性研究结果不尽相同，这也表明不同种族人群中易感基因是有差别的。本文旨在研究中国汉族人群HLADRB1等位基因与结核病易感性的相关性，通过对47例贵州地区汉族结核病人及53例正常对照的研究发现，病人组中DRB1*16等位基因频率明显高于正常对照组(P&<0.05); 而DRB1*11等位基因频率明显低于正常对照组，(P&<0.05)。说明DRB1*16等位基因可能为中国汉族人群结核病的易感基因，DRB1*11等位基因可能为结核病的保护性基因。这与刘志辉[3]等报道的中国南方汉族人群结核病的易感基因为DRB1*16是一致的，但保护性基因却不同，刘志辉[3]等报道的为DRB1*13.3及DRB1*01，而本研究结果为DRB1*11，说明易感基因与保护基因还可能与地域有关， 王敬慧等[4]报道中国北方汉族肺结核可能的易感基因是DRB1*15，可能的抗性基因为DRB1*11，也说明了这一点。国外研究也表明结核病的发病与HLADRB1等位基因密切相关，印度、韩国等均发现[5，6]肺结核的发病与HLADRB1呈正相关，其中印度报道的主要位点是DRB1*1501，而韩国为DRB1*0803。保护性基因却不尽相同，如俄罗斯人为DRB1*03[7]，墨西哥人为DRB1*03和DRB1*07。因此，研究基因与结核病的相关性必须结合种族与地域。导致这种不一致的可能原因为：(1)遗传背景和环境的差异:遗传背景不同，其DRB1等位基因也不同，对疾病结果的影响也不同。环境因素也至关重要，研究表明，基因型完全相同的个体在不同条件下可表现为不同的表型;(2)有些亚型在人群中的携带率偏低，研究可能需要更大样本量[7]。HLADRB1基因与结核病易感性的关联可能是其编码的DR分子参与了结核菌体成分中致病肽的递呈，产生多种细胞因子，诱发细胞免疫应答及迟发性超敏反应，增加或降低了机体对结核病的易感性。也可能HLADRB1基因不是致病的真正基因，而与致病基因连锁。

参考文献

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　　2 林容，薄建萍，蔡望伟，等.NRAMP1基因DNA多态性与海南黎族人结核病易感性的研究[J].实用临床医药杂志，2008， 12(1): 6164.

　　3 刘志辉，罗一鲁，周琳，等.HLADR基因与中国南方汉族部分人群肺结核易感基因的研究[J].中华结核和呼吸杂志，2004，28(6)：390394.

　　4 王敬慧，宋长兴，王苏民，等.人类白细胞抗原DRB1基因与肺结核的相关性研究[J].中华结核和呼吸杂志，2001，28(24)：302306.

　　5 Selvaraj P. HLA antigen profile in pulmonary tuberculosis patients and their spouses[J]. Indian J Med Res，1998，107(2)：155159.

　　6 Kim HS， Park MH， Song EY， et al. Association of HLADR and HLADQ genes with susceptibility to pulmonary tuberculosis in Koreans: preliminary evidence of associations with drug resistance， disease severity， and disease recurrence[J].Hum Immunol，2005，66(10):10741081.

　　7 Nazirov pkh， ubaidullaev AM， Vakhidova GA， et al. Immune status in patients with bone and joint tuberculosis and effect of HLA genotype [J].Probl Tuberk，1993，31:31.

　　8 蒋真，李向培，钱龙等.HLADRB1等位基因在皖籍类风湿关节炎患者的分布[J].安徽医科大学学报，2006，41(3):327329.