Bcl2和Bax在非小细胞肺癌中的表达与MVD的相关性研究

【摘要】 目的：以微血管密度(micro vessel density， MVD)为标记，探讨Bcl2和Bax在非小细胞肺癌(nonsmall cell lung cancer， NSCLC)组织和正常肺组织中的不同表达，及在肺癌发生、转移及预后中的不同表达。方法：采用免疫组织化学的方法(SP法)，检测63例NSCLC标本中Bcl2和Bax蛋白与21例正常肺部组织的细胞表达之间的差异，并测定MVD。结果：Bcl2和Bax之间具有较强的负相关性。Bcl2、Bax表达的阳性率与NSCLC组织分化程度、TNM分期存在显著性差异(P&<0.05)，但与性别及生存期限无关。MVD和分化程度、TNM临床分期及淋巴结是否转移、生存期限有显著性关系，但和吸烟及性别无关，和组织学类型无显著性关系。结论：MVD在癌症早期随Bcl2和Bax一起呈高表达，但随着肿瘤细胞的扩散，Bcl2就失去了调控的作用，即出现基因表达的“钝化”现象。这提供了一条针对早期肺癌MVD升高的Bcl2/Bax分子靶向治疗方法。

【关键词】 非小细胞肺癌;微血管密度;Bcl2; Bax

　　 [ Expression of Bcl2， Bax in nonsmall cell lung cancer and MVD correlations researchZENG Cimei1 ， XU Haixia2(1.Department of Respiratory; 2.Department of Pathology， The People's Hospital of Haikou City Haikou 570208， China)[ABSTRACT] Objective:To explore the expressions difference of Bcl2 and Bax factors in nonsmall cell lung cancer(NSCLC) and normal lung tissues by means of micro vessel density(MVD) symbol. Trace the two factors different expression during carcinogenesis and progression of lung cancer. Methods: To explore expressions difference of Bcl2 and Bax in 63 cases with pathologically diagnosed NSCLC and 31 cases with normal lung tissues. Immunohistochemical technique and MVD count were employed. Results: Negative correlations were observed between Bcl2 and Bax. The positive rate of Bcl2 and Bax expression were significant in the high， middle and low differentiation of NSCLC， and so be the TNM staging of lung cancer Bcl2 (P&<0.05)， but insignificant in gender and survival period. The positive rate of MVD were significant in the high， middle and low differentiation of NSCLC， and so be the TNM staging of lung cancer (P&<0.05)， but insignificant in gender， smoking experience and tissues type.Conclusion: MVD has higher expression with Bcl2 and Bax at early stage. But Bcl2 will be passivated as cancer tissues diffusion. The method shows a new molecular targeted therapy with Bcl2/Bax molecule for lung cancer at early stage.

　　[KEY WORDS] Nonsmall cell lung cancer; Microvessel density; Bcl2; Bax

　　细胞凋亡是细胞正常生命活动中的主动自杀的过程，对细胞的增殖与维持新旧细胞的动态平衡起着非常重要的作用。Bcl2通过抑制诱导细胞凋亡的信号在肿瘤中发生着重要作用，Bcl2基因在许多正常组织和胚胎组织中亦有表达，起着抑制细胞凋亡的作用[1]。目前为大多数学者所认可的观点为：Bax是Bcl2的同源基因，其生物学作用是拮抗Bcl2。 Bcl2/Bax两者的比率，决定了在凋亡刺激信号的作用下细胞是否进入凋亡程序[2]。细胞凋亡与肿瘤的发生、发展及预后有着密切的关系[3]。而肿瘤的生长与转移均依赖于微血管的生成，所以，肿瘤的微血管密度(MVD)被确信为一个可靠的预后因素。近年来许多研究发现肿瘤微血管生成受多种因素的调节，对肺癌微血管生成机制的研究将进一步阐明肺癌的生长、转移机制并为其防治提供理论依据。本文应用免疫组化染色法检测肺癌组织MVD、Bcl2、Bax蛋白表达，探讨其对肺癌演化和预后的影响及相互间的关系。

　　1 资料与方法

　　1.1 实验材料

　　1.1.1 实验标本 选取海口市人民医院2004年3月～2009年2月肺癌手术病例63例。男性 45 例，女性18 例，患者年龄46～79岁，平均62.35岁。其中鳞癌30例，腺癌27例，大细胞癌6例。吸烟者41例，不吸烟者22例。有淋巴转移者33例，无淋巴转移者30例。细胞分化程度为：高分化肺癌23例，中分化肺癌19例，低分化肺癌21例。依据1997年国际抗癌联盟(UICC)修订的标准进行TNM分类和分期，Ⅰ期28例，Ⅱ期17例，Ⅲ期18例。上述病理标本均已由组织学/细胞学检验为确诊病例。另取正常肺组织标本31例。所有患者术前未经化、放疗。

　　1.1.1 实验试剂 鼠抗人Bcl2蛋白单克隆抗体(即用型)，鼠抗人Bax蛋白单克隆抗体，SP免疫试剂盒及DAB显色系统(美国Zymed公司出品)。第一抗体FⅧ为美国Maxim公司生产的多克隆抗体。1.2 方法

　　标本经10%福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm连续切片，分别作Bcl2和Bax免疫组织化学染色(SP)法。60 ℃烘烤1 h，3%h3O2甲醇室温浸泡15 min，0.1 MPa高压修复2 min，血清封闭15 min，加入一抗，DAB显色，用PBS取代一抗作阴性对照，已知阳性切片作阳性对照。以内皮细胞被染成黄色为FⅧ阳性标记。

　　MVD的检测方法：光镜下，在40×10倍视野下选3个被染成棕黄色的微血管最密集视野，计数微血管数，然后求其平均值为MVD，以均数±标准差表示。凡管腔大于8个红细胞大小，带有肌层的血管不予计算。

　　1.3 判断标准

　　Bcl2表达阳性染色定位于胞质和核膜内，Bax定位于细胞浆内，胞质内出现棕黄色颗粒至棕黑色颗粒为阳性细胞。在400倍镜下进行微血管计数。按标记指数=(阳性细胞数/总计数细胞数)×100%，分为：不显色为(-)、&<25%为(+)、25%～50%为(++)、﹥50%为(+++)。

　　1.4 统计学处理

　　采用SPSS12.0软件完成全部统计数据的处理。两独立样本采用 t检验和方差分析的方法，计数资料用χ2检验，

　　2 结果

　　2.1 临床表现和实验室检查

　　Bcl2和Bax因子的表达、MVD与肿瘤病理学特征有着密切的联系。Bcl2和Bax这一对同源基因之间呈现较强的负相关性。本组31例正常肺组织中Bcl2阳性7例(22.58 %)，Bax阳性24例 (77.42 %)，MVD为(12.28±3.23);63例肺癌组织中Bcl2阳性35例(55.56 %)，Bax阳性28例 (44.44 %)，MVD为(35.46±11.16)。无论是正常组织样本还是肺部组织样本，在相同样本的条件下，它们阳性表达的百分率相加之和约为100%(22.58%+77.42%≈100%，55.56%+44.44%≈100%)。两者的表达蛋白主要显色于癌细胞核膜及胞浆内，肿瘤间质内少量淋巴细胞表达阳性。本组结果显示，正常肺组织与NSCLC之间的Bcl2、Bax、MVD的表达，均有显著性差异(P&<0.05)。NSCLC组织分化程度和Bcl2表达之间存在显著性差异(P&<0.05)，处于TNM分期Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期的Bcl2表达阳性率亦存在显著性差异(P&<0.05)。鳞癌的Bcl2阳性表达率略高于腺癌，吸烟组略高于不吸烟组，有淋巴结转移组略高于无淋巴结转移组，但均无统计学意义(P&>0.05)。Bcl2与性别及生存期限无关。MVD和分化程度有显著性关系，低分化MVD(48.87±13.73)明显高于中高分化(26.95±8.81)(P&<0.05);和TNM临床分期有显著性关系，临床Ⅲ～Ⅳ期MVD(49.01±15.79)明显高于临床I～II期(24.59±5.32)(P&<0.05);和淋巴结转移有显著性关系，有淋巴结转移MVD(45.62±15.72)明显高于无淋巴结转移(30.76±9.47)(P&<0.05);对生存期限的影响，除了&<1年与1～2年差别无统计学意义外，其他两两间差别有统计学意义，生存期&<1年的MVD(49.15±16.46)明显高于&>2年(28.84±9.38)(P&<0.05)。此外，MVD和吸烟、性别无关，和组织学类型的关系大细胞癌略高于鳞癌、腺癌，但无统计学意义(P&>0.05)，和鳞癌腺癌之间无关。本组未讨论小细胞癌与MVD、Bcl2、Bax之间的关系。见表1。表1 临床病理特征与MVD、Bcl2的关系注:*MVD以35.46为样本均数;△采用SNKQ对组织学类型进行两两比较，结果表明，除了鳞癌与腺癌差别无统计学意义外，其他两两间差别有统计学意义;☆采用SNKQ对生存期限进行两两比较，除了&<1年与1～2年差别无统计学意义外，其他两两间差别有统计学意义。

　　3 讨论

　　Bcl2和Bax因子是最早发现的细胞凋亡相关基因之一。Bcl2通过抑制诱导细胞凋亡的信号在肿瘤中发生着重要作用，Bcl2基因起着抑制细胞凋亡的作用[1]，Bax是Bcl2同源基因，其生物学作用是拮抗Bcl2，起促进细胞凋亡的作用。Bax通过形成Bax同二聚体，并与Bcl2结合，形成Bax-Bcl2异二聚体，从而起到促进细胞凋亡的作用。Bcl2/Bax两者的比率，决定了在凋亡刺激信号的作用下细胞是否进入凋亡[2]。近年研究发现，两者与胃癌、子宫内膜癌、淋巴癌、肺癌等的发生、发展及MDR(多药耐药)有关。细胞凋亡是维持细胞新旧更替、保持细胞数量动态平衡的关键活动，它与肿瘤的发生、发展及预后有着密切的关系[3]。肿瘤微血管生成是反映肿瘤恶性生物学行为的重要参数。有人认为肿瘤的生长与扩散取决于微血管的生成，标记血管内皮(EC)标志性抗原(FⅧ、CD31、CD34等)检测组织的MVD可反映肿瘤血管生成状况。本文采用SP法标记FⅧ研究了63例肺癌标本，结果显示：淋巴结有转移、临床分期较晚的患者MVD明显增高，说明肿瘤血管生成参与并影响着肿瘤的演进过程。肿瘤通过诱导血管的生成促进自身的发生和发展，并促进其转移而影响患者生存。实验发现TNM分期Ⅲ～Ⅳ期患者的MVD水平明显高于I～II期患者。有生存分析表明，MVD表达低的患者其术后生存率明显高于MVD高表达患者，证实了MVD可与作为肺癌患者的预后指标。

　　Bcl2和Bax这一对同源基因是细胞凋亡的控制基因，通过抑制细胞的凋亡过程延长细胞寿命。本组研究中发现，肿瘤的分化程度愈高，Bcl2阳性表达率也增高，Bax阳性表达则相应降低。可能Bcl2和Bax基因表达是肺癌发生的早期事件，随着病情的发展，肿瘤获得恶性表型，Bcl2和Bax基因受到p53、Cmyc等的调控处于低表达状态，使其在肺癌晚期已不起主要作用甚至不起作用，本研究把这种现象称为基因表达的“钝化”现象。这种现象为“由Bcl2因子突变而触发其他因子随之变异从而引起正常细胞的癌变”提供了佐证。Bcl2和Bax基因不但有抑制肿瘤细胞凋亡而延长细胞生命的作用，还与肿瘤细胞分化有关，可作为判断肺癌生物学行为的参考指标。本文结果显示，MVD在癌症早期会随Bcl2蛋白一起有明显的增长过程，由此说明Bcl2在肺癌的发展初期有促进肿瘤微血管生成的作用。但随着肿瘤细胞的扩散，特别是癌细胞获得恶性表型后，Bcl2就失去了调控的作用。这说明在癌细胞生长过程中会有其他因素也参与其中。肿瘤微血管生成是一极其复杂的过程，受多种正负调节因子调控。其中血管内皮生长因子(VEGF)是重要血管内皮生成刺激因子，它可与血管内皮细胞相应受体结合、刺激血管内皮的增殖。文献研究表明，VEGF的表达与MVD呈正相关，Bcl2基因表达对VEGF产生及癌细胞中的血管内细胞的迁移有抑制作用，并发现VEGF的高活性与Bcl2缺失有关[4]。近期研究发现突变型p53基因可上调肿瘤VEGF水平，进而促进肿瘤血管生成，从而增加MVD[5]，并且有学者发现突变型p53与Bcl2之间呈负相关[6，7]，提示Bcl2可能与多因素相互作用，并通过VEGF途径影响微血管的生成，MVD值也随之增加。近期关于Bcl2和Bax蛋白的分子靶点研究报道很多。Bcl2和Bax蛋白功能并非正常细胞必须，但是100%的小细胞肺癌都伴随着Bcl2和Bax的高表达结果。这是肿瘤细胞的基因特性赋予肿瘤细胞逃避凋亡，获得永生的特点[8]。

　　综上所述，Bcl2和Bax及MVD这三个与肺癌密切相关的因子互相补充，可以用于判断肺癌恶性程度、预计复发转移及预后情况，从而为指导制定合理的个体综合治疗方案提供直接证据。上述研究表明，Bcl2和MVD在早期肺癌中都有着高表达结果，提供了一条针对早期肺癌MVD升高的Bcl2分子靶向治疗方法。所以，特异性拮抗Bcl2和促Bax蛋白的分子靶向，通过诱导肿瘤细胞凋亡，从而实现高选择性、安全、高效、低痛苦抗癌的临床目标。微血管为肺癌的浸润、转移提供了理想的信道，因此，通过测量肺癌MVD(即降低MVD值)进而确定抑制肺部肿瘤的浸润转移，可为临床治疗方案提供良好的支持。

参考文献

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