荧光原位杂交检测宫颈脱落细胞hTERC基因实验方法比较观察

【摘要】 目的：探讨荧光原位杂交技术检测端粒酶基因(hTERC)实验方法的最佳方案。方法：采集海医附院收治的140例患者的宫颈脱落细胞，分别应用液基取材刷、无菌棉签取材法;生理盐水低渗、TCT低渗、直接取液滴片、TCT直接低渗4种制片方法;水浴和直接消化法;甲酰胺法和共变性法，通过检测宫颈脱落细胞hTERC基因表达成功率，对比实验方法的最佳方案。结果：取材方法中液基取材刷与无菌棉签的细胞数量满意率分别为95.5%、14.3%，2种方法差异有统计学意义(P&<0.05) ;生理盐水低渗、TCT低渗、直接取液滴片、TCT直接低渗4种方法杂交成功率分别是80.0%、84.8%、46.2%、82.1%，其中直接取液滴片与其他法差异有统计学意义 (P&<0.05)，其他方法之间比较差异无统计学意义(P&>0.05);2种消化法中水浴和直接法杂交成功率分别为88.9%、94.1%，差异无统计学意义(P&>0.05)，杂信号比例分别为16.7%、45.6%，差异有统计学意义(P&<0.05);2种变性法中甲酰胺法和共变性法杂交成功率分别为72.3%、96.0%，差异有统计学意义(P&<0.05)。结论：荧光原位杂交技术检测宫颈脱落细胞hTERC基因时，以液基取材刷取材细胞数量多，TCT低渗方法制片效果最好，水浴法和共变性杂交成功率最高。

【关键词】 荧光原位杂交;宫颈脱落细胞;TERC基因

　　 [ABSTRACT] Objective: To investigate the optimal methods of fluorescence in situ hybridization on hTERC gene detection. Methods： 140 samples of cervical exfoliated cells were gathered by fluidbase brush sampling and aseptic cotton sampling in the Affiliated Hospital of Hainan Medical College; movies were made by physiological saline infiltration， TCT infiltration， direct dropping and direct TCT infiltration. All experimental methods， bath and direct digestion， formamide and denaturation law， were compared by detecting the success expression of cervix castoff cells hTERC gene. Results： In sampling methods， the satisfactory rate of cell quantity in fluidbase brush and aseptic cotton were 95.5% and 14.3%( P&<0.05); In hybridization technique， the success rate of 4 methods were 80.0%，84.8%，46.2%，82.1%， respectively， compared to direct dropping method， other three methods were preferable (P&<0.05) and with no differences among them. In two digest methods， the success rate of hybridization were 88.9% and 94.1%， respectively， and with no difference(P&>0.05). But hybridization signal ratio were 16.7% and 45.6%， with significant difference(P&<0.05). In two denaturation methods， the success rate were 72.3% and 96.0%，with significant difference(P&<0.05). Conclusion： Detecting hTERC gene by fluorescence in situ hybridization， fluidbase brush is better sampling of quantity cells， TCT infiltration is preferable in making movies， bath and hybridization variability have higher success rate.

　　[KEY WORDS] Fluorescence in situ hybridization; Cervical exfoliated cells; TERC gene

　　随着分子生物学的发展，人们运用荧光原位杂交( fluorescence in situ hybridization， FISH)技术检测宫颈脱落细胞中3号染色体长臂26. 3位点端粒酶基因( human telomerase RNA component，hTERC)的扩增，发现它与宫颈病变有着密切的关系[1]。FISH的原理是以已知的标记单链核酸为探针，按碱基互补原则，与待检材料中未知单链核酸进行结合，形成荧光显微镜下可检测的荧光信号，本实验从取材、制片、消化、变性4个方面，探讨实验方法对FISH杂交率的影响。

　　1 材料与方法

　　1. 1 材料来源

　　收集2007年11月～2009年3月在海南医学院临床附属医院就诊的140例妇科患者的宫颈脱落细胞标本(排除严重内科疾病及生殖系统炎症)。

　　1. 2 方法

　　FISH检测均以细胞学检查和组织病理学结果为参照标准。

　　1. 2. 1 取材 (1)液基取材刷：患者取膀胱结石位，暴露宫颈，干棉签擦拭分泌物，使用一次性TCT毛刷插入宫颈口，在宫颈外口鳞柱状上皮交界处，以宫颈外口为中心，均匀按顺(逆)时针旋转5周，停留10 s左右，将宫颈刷置于TCT液基中保存;(2)无菌棉签：取材方法同前，棉签放于生理盐水中保存。

　　1. 2. 2 制片 (1)生理盐水低渗：将生理盐水细胞储存液充分震荡10 min，放置1～2 min后取10 mL细胞储存液 ， 1 500 r/min 离心10 min， 去上清，如细胞少，可再取更多液体。加5 mL胶原酶B， 37℃水浴30 min，间断吹打，离心，加5mL去离子水37℃水浴20 min，加入2mL固定液(冰乙酸∶甲醇=1∶3)固定10 min，离心后弃上清，吹打悬浮细胞，重复2次固定，取适量密度细胞悬液10 μL用移液器滴片。(2)TCT低渗：胶原酶B 20 min，去离子水40 min，其余处理同生理盐水法。(3)直接取液滴片：取10 mL细胞储存液 ， 1 500 r/min 离心10 min， 去上清，滴片同前，滴片后用95%乙醇固定10 min。(4)TCT直接低渗：不加胶原酶B ，余同TCT低渗。4种方法制片后均自然干燥，室温下过夜老化。

　　1.2.3 消化 (1)水浴法：37℃ 0. 01mol/L HCl 40 mL加胃酶20mg/mL取80 μL，10 min;(2)直接法：室温下于玻片中细胞圈上直接加10 μL胃酶20 mg/mL，10 s。

　　1.2.4 变性 探针由北京金菩嘉医疗科技公司提供， 为hTERC /CSP3 DNA 探针， 杂交到3 号染色体3q2613，荧光信号为红色(四甲基罗丹明) ， CSP3作为对照探针，荧光信号为绿色(细胞绿) 。变性：(1)甲酰胺法：70%甲酰胺2 ×SSC液(75℃)水浴中变性5 min，然后立即-20℃乙醇梯度脱水各3 min，自然干燥后， 46℃烤片机烤干等待杂交，将配制的探针混合液(杂交混合液 7 μL、3号探针2 μL、去离子水1 μL)变性后加于玻片上，封片，入湿盒;(2)共变性法：探针混合液加至细胞圈上，盖上盖玻片，封片，置于80 ℃铁盒内(提前加热，保持干燥)，将湿盒置于42℃恒温孵箱中过夜杂交。

　　1.2.5 洗涤观察 将杂交后的玻片置于46 ℃ 50%甲酰胺/2 ×SSC液洗3次(10 min) ， 2 ×SSC液(10 min， 46 ℃) 、NP40洗5 min ( 46 ℃) ，洗涤完毕后，将玻片置于70%乙醇中3 min，自然干燥后，加10 μL DAPI，加盖玻片，暗处放置10～20 min; 荧光显微镜下观察。

　　1.3 判断标准

　　1.3.1 制片评价标准 (1)细胞数量：采用细胞计数板，每张玻片至少1 000个细胞以上为满意。(2)细胞分散度：满意：细胞分布均匀，平铺，重叠少，聚集少，密度适中，否则为不满意。(3)玻片背景：背景清晰，细胞碎片、炎症细胞量、红细胞数、黏液包裹少为满意，否则为不满意。(4)细胞核形态：细胞核形态正常为满意，核小，过大破裂均为不满意。

　　1.3.2 消化判断标准 (1)满意：细胞核完整，饱满，实亮，胞浆稀薄，无黏液包裹，背景干净;(2)不满意：太过：核破裂，空洞，核膜呈锯齿状，核虚而分散稀薄，背景呈星空状;不及：胞浆紧实，有黏液包裹，DAPI进入核区困难，核染色浅淡，红、绿通道下无法显示细胞核轮廓。

　　1.3.3 FISH成功判断 (1)杂交率：每张涂片可观察200个细胞完整信号，完整信号细胞数/总细胞数×100%，少于200个则为失败;(2)信号强弱：荧光信号较强、红绿信号均清晰可辨为满意，荧光信号弱、不能观察计数或红绿信号缺失为不满意。

　　1.3.4 结果判断 本实验室根据20例正常宫颈脱落细胞建立的阈值4.45%为标准，计数100个细胞大于4个异常扩增的样本则为阳性，反之为阴性。正常细胞表现为红色∶绿色信号=2∶2(个)，如红色信号多于2则为异常细胞(红信号表示hTERC基因，绿信号为着丝粒)。

　　1. 4 统计学处理

　　采用χ2 检验，检验标准α = 0. 05。

　　2 结果

　　 2. 1 取材方法

　　133例液基取材刷与7例无菌棉签的细胞数量满意率分别为95.5%(127/133)、14.3%(1/7)，2种方法差异有统计学意义( P&<0.05) 。

　　2.2 制片方法

　　25例生理盐水低渗、46例TCT低渗、13例直接取液滴片、56例TCT直接低渗制片细胞数满意率分别为68.0%、65.2%、92.3%、75.0%，直接取液滴片组与其他组对比差异有统计学意义( P&<0.05)，其次为TCT直接低渗法较好;各组之间细胞分散度满意率分别为80.0%、84.8%、38.5%、64.3%，差异有统计学意义(P&<0.05)，TCT低渗最好，直接取液滴片最低;各组之间玻片背景清晰满意率分别为60.0%、76.1%、38.5%、62.5%，直接取液滴片组与其他组对比差异有统计学意义(P&<0.05)，以TCT低渗法最好，直接取液滴片组最低;杂交成功率分别为80.0%、84.8%、46.2%、82.1%，直接取液滴片组与其他组对比差异有统计学意义(P&<0.05)，其中TCT低渗法杂交率最高，见表1。表1 各组制片方法效果的比较

　　2.3 消化方法

　　72例水浴法和68例直接法杂交成功率分别为88.9%(64/72)、94.1%(64/68)，差异无统计学意义(P&>0.05);杂信号比例分别为16.7%、45.6%，差异有统计学意义(P&<0.05)。

　　2.4 变性方法

　　65例甲酰胺法和75例共变性法杂交成功率分别为72.3%(47/65)、96.0%(72/75)，差异有统计学意义(P&<0.05)。

　　3 讨论

　　现代细胞遗传学和分子生物学研究表明，大多数实体肿瘤细胞，常表现为染色体不稳定性，即染色体数目的改变和染色体结构异常。对宫颈癌染色体不稳定的研究显示，常见染色体3q增加和2，3，4，6p，11q的缺失，并且异常基因区多位于3q26.1-q28，其中涉及到的最重要的基因可能是人类染色体端粒酶(hTERC基因图位于3q26.3)基因。研究发现，宫颈细胞由非典型性发育异常向宫颈癌转变的过程中几乎都伴有3号染色体长臂扩增。有学者采用FISH技术检测液基细胞学样本，发现3q26.3扩增比例在宫颈高度病变与鳞癌中占较高百分率，而在正常宫颈与非典型鳞状上皮细胞中不出现显著扩增[13]。因此，对hTERC基因扩增的检测有助于宫颈癌的筛查及早期诊断，而检测基因扩增的标准方法即为FISH[46]。采用荧光标记的探针，与被检测样本中的DNA杂交后，在荧光显微镜下检测荧光信号而得出结果。FISH具有较好的灵敏性及特异性，并且不需要细胞培养，可以用于间期细胞。本实验从取材、制片、消化、变性几个方面探讨实验方法对FISH检测的影响。从取材方法来看，无菌棉签与液基取材刷相比，无菌棉签采集脱落细胞数量明显少于取材刷法，原因在于细胞黏附在棉签上，震荡后仍有大部分细胞吸附其上。从制片方法来看，TCT低渗法较生理盐水、TCT直接低渗法和直接涂片法在细胞分散度、细胞核形态、背景情况上效果好，但细胞数量要低。直接涂片法细胞数量多，但细胞分布不均，黏液、杂质多。生理盐水法细胞形态保持较好，但黏液对杂交有一定的影响，而且炎症细胞和血细胞也在一定程度上干扰信号的判读。TCT直接低渗法与TCT低渗法差异为不加用胶原酶B，结果显示在细胞分散度、背景、杂信号方面不如TCT低渗法满意。出现以上现象的原因可能在于：(1)通过胶原酶、低渗、反复离心去上清、吹打使细胞数量受到一定损失;(2)TCT液基成分对细胞悬液中黏液、炎症细胞、红细胞、杂质的处理有一定的帮助;(3)胶原酶、低渗的运用可进一步消化黏液和膨胀、疏松细胞核，为杂交做好准备。从消化方法来看，直接法较水浴杂交率稍高，但非特异性信号较多，对结果判读有一定影响，需加强洗涤以解决，水浴法存在有消化不足现象，细胞膜较厚时需延长消化时间。消化在杂交中起着重要的作用，胃酶的浓度、时间和温度，如消化不够或太过则杂交失败可能性较大。从变性方法来看，共变性法较甲酰胺法效果要好，杂交率高，背景清晰，荧光信号亮，且操作简单快捷。原因分析：共变性使细胞DNA和探针处在共同的温度、湿度环境中变性、杂交，减少了-20℃乙醇防复性的影响，另外，无甲酰胺pH值的影响。

　　综上所述，FISH技术检测hTERC基因成功与否的关键在于制片质量、胃酶消化浓度和时间，其次为变性时间和温度上的掌握。本实验表明: 应用FISH技术检测宫颈脱落细胞hTERC基因时，比较上述多种方法，其中以液基取材刷取材细胞数量多，TCT低渗方法制片效果最好，水浴法消化和共变性杂交成功率最高。 值得注意的是，消化的浓度和时间可根据每张制片细胞的具体情况灵活进行调整。FISH技术因其具有较高特异性、敏感性和快速、操作简单、无创等特点，从一定程度上弥补现行宫颈癌和癌前病变筛查方法的局限性，因此可作为临床宫颈疾病筛查一项重要的辅助检查。

参考文献

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