淫羊藿苷对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

　　　　　　作者：蒋绍艳 ，宋丹妮 ，史玉朋 ，常宏

【摘要】 目的：探讨淫羊藿苷对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。方法：采用差速贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，流式细胞仪鉴定表面标志。取第3代细胞加入106 mol/L淫羊藿苷培养基，对照组仅加入等量普通培养基进行培养。通过镜下观察细胞形态，流式细胞仪测定细胞表面标志，碱性磷酸酶试剂盒测定诱导细胞碱性磷酸酶活性，组织化学染色观察钙化结节形成能力。结果：体外培养的细胞表达CD29、CD44、CD105、CD166。淫羊藿苷诱导组细胞碱性磷酸酶呈阳性反应并有钙化结节形成，而对照组未见钙化结节形成。结论：淫羊藿苷能够诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，可视为一种良好的骨诱导活性因子。

【关键词】 淫羊藿苷;骨髓间充质干细胞;成骨分化

　　 [ABSTRACT] Objective: To study the effects of icariin on osteogenic differentiation of rat BMSCs.Methods: Rat BMSCs were isolated and cultured in vitro. At the third passage， rat BMSCs were treated with 106mol/L icariin medium. BMSCs in the control group were treated with an equal volume of medium. Cells were identified by flow cytometry.Alkaline phosphatase were detected by alkaline phosphatase kit， and Calcified nodules were observed using immunohistochemistry staining. Results: Flow cytometry analysis showed that BMSCs cultured in vitro expressed mesenchymal cell marker，including the positive expression of CD29、CD44、CD105 and CD166. The staining of the alkaline phosphatase and calcified nodules were positive after osteoinduction， but calcified nodules were not found in rat BMSCs in the control group.Conclusion: Icariin can induce osteogenic differentiation of rat BMSCs and can be used as an osteoinductive factor.

　　[KEY WORDS] Icariin; Bone marrow mysenchymal stem cells; Osteogenic differentiation

　　骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells， BMSCs) 是骨髓造血微环境中的一种重要细胞成分，具有多向分化潜能，在一定的诱导条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞及神经细胞等[1]，在组织工程和细胞治疗等方面具有广阔的应用前景。淫羊藿是中医治疗骨质疏松的常用药物，而淫羊藿苷是发挥药理活性的主要物质 [2]，大量研究[310]证实淫羊藿苷能够促进体外培养成骨细胞的增殖与分化，但有关淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞的作用报道甚少。本研究通过体外分离培养大鼠BMSCs，探讨淫羊藿苷对其向成骨细胞分化的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物、试剂与仪器

　　选取2月龄清洁级SD大鼠，体重180～200 g，购于中山大学实验动物中心。 胎牛血清(Hyclone公司)、LDMEM培养基(GIBCO公司)、二甲基亚砜(DMSO Sigma公司)、淫羊藿苷标准品(中国药品生物制品检定所)、四甲基偶氮唑盐(Sigma公司)、碱性磷酸酶试剂盒(ALP)、CO2培养箱(Forma公司)、倒置显微镜(Olympus公司)、超速离心机(Sigma公司)、流式细胞仪(美国BD公司 Ver3.0)、细胞计数仪(Sysmex公司 F820)。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 大鼠BMSCs体外分离、扩增、纯化 无菌条件下取大鼠股骨、胫骨，用含抗凝剂的无血清LDMEM培养基反复冲洗骨髓腔，移入离心管，加入适量PBS缓冲液，1 500 rpm离心10 min，弃上清液及脂肪层，再重复离心1次。重悬细胞沉淀，加入含10%FBS的LDMEM培养基调整细胞密度，按1×106/mL接种，置于37 ℃、饱和湿度的CO2孵箱内培养，3 d后半量换液，5 d全量换液，弃掉未贴壁细胞，以后每2～3 d换液1次，7～9 d左右细胞达80%融合，用0.25%胰酶(含0.02%EDTA)消化1 min，加入含血清培养基终止消化，1 500 rpm离心，弃上清后重悬细胞，按1∶3接种传代。每日倒置显微镜下观察原代及传代细胞的生长状况及形态特征。

　　1.2.2 大鼠BMSCs流式细胞仪鉴定 取P3代细胞近80%融合后吸掉培养液，0.25 %胰酶室温消化2 min，吹打成单细胞悬液，PBS洗3次，应用流式细胞仪检测细胞表面抗原表达。

　　1.2.3 淫羊藿苷对BMSCs成骨分化的影响 取P3代细胞以1×104/mL接种于96孔培养板，在37 ℃、5%CO2饱和湿度的CO2培养箱中培养。24 h细胞完全贴壁吸去原培养基，对照组继续用完全培养基培养，淫羊藿苷用基础诱导培养液加淫羊藿苷10～6 mol/L，每隔2～3 d换液。

　　1.2.4 碱性磷酸酶(ALP)活性测定 成骨诱导培养第5天采用重氮盐法(改良Kaplow法)染色，可见胞浆有蓝染颗粒或块状沉淀，为ALP阳性反应。

　　1.2.5 钙化结节免疫组化染色 成骨诱导培养第15天采用VonKossa法进行钙化结节的组织化学染色。PBS冲洗2次，95%乙醇固定10 min，蒸馏水冲洗3次。加2 g/dL硝酸银置暗处1 h。蒸馏水冲洗3次，再用流水冲洗10 min，5 g/dL硫代硫酸钠还原1 h，干燥封片。钙化结节呈黑色。

　　2 结果

　　2.1 大鼠BMSCs形态学特征

　　原代细胞24 h部分开始贴壁，呈透亮圆形;48 h可见大量圆形细胞贴壁，部分细胞呈现细长梭形;5 d可见贴壁细胞呈单个分散或成簇生长，细胞形态均匀，多呈长梭形、纺锤形;培养至7～9 d细胞达80%～90%融合。传代细胞12 h内完全贴壁，48 h后进入增殖期，4～5 d细胞达到完全融合，排列呈现旋涡状，未见细胞接触抑制。

　　2.2 大鼠BMSCs流式细胞仪鉴定

　　流式细胞仪检测结果显示CD29、CD44、CD105、CD166表达阳性，CD34、CD80、CD86阴性，BMSCs均一性好，纯度达97%以上。

　　2.3 淫羊藿苷组细胞的形态学特征

　　BMSCs由梭形或纺锤形变成多边形或方形等多种形态，细胞重叠，细胞之间界限模糊，逐渐形成了多个散在的细胞结节，胞质中出现钙盐结晶体。

　　2.4 ALP染色

　　淫羊藿苷组细胞的胞浆中可见棕黄色的细小颗粒，ALP染色阳性，在细胞密集区反应强烈;对照组细胞仍为梭形，ALP染色呈阴性。

　　2.5 Von Kossa染色

　　苏木素复染可见淫羊藿苷组细胞胞浆呈棕黑色，内有大量棕黑色细小均匀颗粒，细胞表现明显成骨活性。

　　　3 讨论

　　早在1976年Fridedenstein等[11]研究发现骨髓中存在一类具有多向分化潜能的细胞，在不同条件下可被诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、血管内皮细胞及神经细胞等，称之为骨髓间充质干细胞。由于其具有成骨分化能力，免疫原性较弱[12]，且获取相对容易。因此，被认为是目前骨组织工程种子细胞的重要来源，具有广阔的应用前景。BMSCs是一群具有独特表型的细胞，它表达多种表面标记物，包括粘附分子、生长因子、整和素和细胞因子及其受体等。流式细胞仪检测结果显示：CD29、CD44、CD105、CD166表达阳性，CD34、CD80、CD86阴性。本实验所得结果与Pittenger等[13]报道的BMSCs表面标志CD29、CD44、CD166、CD105等阳性，不表达CD34、CD45、CD14等相似，证明所分离培养的细胞确为BMSCs。

　　淫羊藿苷是传统中药淫羊藿的有效药理成分，现代药理学研究表明，其具有免疫调节、抗肿瘤、影响内分泌和心血管系统等多种重要的生物活性。近年来已被广泛用于抗骨质疏松治疗和成骨、破骨细胞研究。本研究发现淫羊藿苷诱导后BMSCs细胞形态逐渐发生改变，由原来的梭形变成多边形或方形，与成骨细胞形态和生长特点相似。ALP被认为是BMSCs的早期成骨分化指标，5 d时检测淫羊藿苷组细胞ALP表达呈阳性，而对照组表达阴性，证明淫羊藿苷具有成骨诱导活性。15 d后，可见细胞外钙盐沉积，部分细胞呈聚集样生长，在聚集生长的中心可见钙化结节，而钙化结节是成骨细胞功能活动的表现形式;对照组细胞则未见钙化结节形成，细胞亦无聚集生长趋势。综合以上结果，淫羊藿苷可通过诱导碱性磷酸酶和钙化结节形成促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化，可视为一种良好的骨诱导活性因子。

参考文献

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