作者：王德山，王哲，单德红，太史春
【摘要】 目的 检测肺气虚大鼠肾脏组织与钠离子转运相关蛋白表达，为中医学肺肾相关理论提供实验依据。方法 复制肺气虚大鼠模型，应用免疫组化方法检测肾小管上皮性Na+通道(ENaC)、Na+-K+-2Cl-转运体(rBSCl)蛋白表达，放免方法测定血浆与肺组织中醛固酮(ALD)、心房钠尿素(ANP)含量。结果 与对照组比较，模型组大鼠肾小管ENaC、rBSCl蛋白表达明显上调，同时血浆与肺组织中ALD水平升高而ANP水平下降。结论 肺组织通过释放ALD和ANP调节肾小管上皮细胞ENaC、rBSCl蛋白表达，从而调节肾小管对Na+与水的重吸收而影响机体水液代谢过程。
【关键词】 肺气虚证;上皮性Na+通道;Na+-K+-2Cl-转运体;醛固酮;心钠素;大鼠
Abstract：Objective To study the relationship of lung and kidney in TCM by detecting the protein expression related to Na+ transportation in the kidney tissue of Lung-Qi deficiency model rats. Methods Lung-Qi deficiency model of rats were copied. Immunohistochemistry was applied to measure the expressions of ENaC and rBSCl in renal tubular epithelium. RIA was used to detect ALD and ANP levels in plasma and lung tissue. Results Compared with the control group， expressions of ENaC and rBSCl of renal tubule were upregulated markedly， ALD level increased and ANP level decreased obviously in the model group. Conclusion Lung can regulate the expressions of ENaC and rBSCl in the renal tubule by secreting ALD and ANP， which can regulate Na+ and water reabsorption in the renal tubule and then influence the water metabolism of the body.
Key words：Lung-Qi deficiency model;ENaC;rBSCl;ALD;ANP;rat
中医学理论认为，在机体水液代谢过程中肾主水液，肺主行水，两者关系极为密切，在病理状态下，一脏受损则极易影响彼脏。但是，现代医学对于肺与肾两脏之间在水液代谢过程中相互依存和影响的机制尚不明确。本研究以中医理论为指导，建立肺气虚证动物模型，检测肾小管与Na+转运相关蛋白变化，为“肺肾”两脏在体内水液代谢过程中相互关联的科学内涵提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 动物与分组
健康Wistar大鼠20只，雌雄不拘，重量为(200±25)g，周龄6～8周，辽宁中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK(辽)2004-0018。随机分为对照组和模型组，每组10只。
1.2 造模
参照文献[1]方法进行动物模型复制，并于模型复制的第1、14日用10%水合氯醛腹腔麻醉后，行气管内注入LPS 200 ?g/200 ?L，庆大霉素局部抗炎，缝合皮肤并消毒。术后第2～13、15～28日，置于1 m3的烟室中，香烟(焦油量为12 mg，烟气烟碱量为1.1 mg)烟熏，每日30 min;自由进食、饮水。对照组：将每只大鼠于第1、14日气管内注入0.9%氯化钠注射液200 ?L;于第2～13、15～28日，置于无烟熏同样环境中饲养。
1.3 观察指标
1.3.1 一般状况及肺组织病理变化 观察各组大鼠活动量、皮毛、食量、呼吸、咳嗽、大便等情况，以反映气虚的有无和程度的轻重。并于造模28 d后用10%水合氯醛3 mL/kg体重腹腔麻醉后，取左肺下叶，常规石蜡切片、HE染色，光镜观察肺组织变化。
1.3.2 血浆中醛固酮、心钠素的检测 于造模28 d 后用10%水合氯醛3 mL/kg体重腹腔麻醉后，从大鼠腹主动脉取血5 mL，分别注入空白试管中及加肝素的试管中，静置30 min，4 ℃ 3 000 r/min离心10 min，分离血清，-70 ℃保存。采用放射免疫分析技术检测血浆醛固酮(ALD)、心房钠尿素(ANP)含量，按试剂盒说明书操作。放射免疫检测在中国医科大学核医学室完成。
1.3.3 检测肾组织钠离子转运相关蛋白表达 采用免疫组化方法检测，应用常规手术方法进行动物放血后，立即剪开胸、腹腔取出右肾，将肾组织用4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋，连续切片，片厚5 ?m。按试剂盒操作，检测肾小管上皮性Na+通道(ENaC)及Na+-K+-2Cl-转运体(rBSCl)，以细胞膜或细胞浆内出现清晰棕褐色颗粒为阳性。对免疫组化的结果进行分析：将每只动物随机取相同部位3～4张切片置于显微镜下，使用BI2000医学图象分析系统测定阳性反应物的灰度值。
1.4 统计学方法
采用SPSS10.0统计学软件进行数据处理，P&<0.05为差异有统计学意义，实验数据均以—(—数)±s表示，组间比较采用t检验。
2 结果
2.1 肺气虚证模型大鼠一般状态的变化
对照组大鼠活泼好动，皮毛光泽，饮食自如，体重逐渐增加，呼吸平稳，口鼻清洁红润、体重稳步增长。模型组大鼠先后出现咳嗽、气急、喘鸣、鼻部潮湿微红、精神萎靡、行动迟缓、蜷伏不动、毛失光泽并有脱落等症状，同时食量逐渐减少，大便变软变稀，体重进行性减少。肉眼所见：对照组大鼠两肺体积正常，粉红色，弹性好，无异常改变;模型组大鼠两肺呈膨胀状态，体积增大，边缘变钝，颜色变白，肺表面可见小囊泡状突起，可见少量渗出液。光镜所见：对照组支气管、肺泡匀无异常所见;模型组大鼠气管、支气管及肺泡有明显炎细胞浸润;管腔狭窄，肺泡膨大，泡壁变薄，呈肺气肿表现;血管扩张充血，局部肺泡腔内可见水肿液。综合上述，符合肺气虚造模标准。尿量及尿比重变化见表1。表1 肺气虚证模型大鼠尿量、尿比重的变化(—(—虚)±s)注：与对照组比较，**P&<0.01(下同)
2.2 肺气虚证模型大鼠肾小管上皮性Na+通道及Na+-K+-2Cl-转运体表达变化
光镜下观察发现，肾组织ENaC表达部位多沿着肾小管管壁周围分布，特别在肾近曲小管管壁周围最为密集，并呈现棕黄色;rBSCl的表达部位主要在肾远曲小管处分布比较密集，其颜色也以棕黄色为主。与对照组比较，模型组肾小管周围分布的rBSCl和ENaC均明显增加，2组灰度值差异有统计学意义(P&<0.05)。见表2。表2 肺气虚证模型大鼠肾小管ENaC与rBSCl蛋白表达变化(—(—达)±s，灰度值)
2.3 肺气虚证模型大鼠血浆与肺组织中醛固酮与心钠素含量变化(见表3)表3 肺气虚证模型大鼠血浆及肺组织匀浆中ALD与ANP含量变化
3 讨论
现代医学认为，影响全身水盐代谢最重要的器官是肾脏，调节机体水盐代谢、维持电解质平衡等其关键在于肾小管和集合管选择性重吸收功能，而Na+的转运是带动和促进肾小管和集合管对各种物质的重吸收最重要的离子，ENaC以及rBSCl均为Na+转运的主要通道蛋白与转运子，前者大部分沿着肾小管管腔膜分布，ENaC 表达量直接调控着Na+重吸收，进而影响水和Cl-的重吸收;而后者则主要分布在肾外髓部髓攀升支粗段管腔侧上皮细胞膜上，通常与K+、Cl-形成Na+-K+-2Cl-转运体，主动将其转运到外髓部小管之间，以提高其间质高渗梯度，进而促进水的重吸收。所以，ENaC以及rBSCl的表达变化直接影响肾小管、集合管重吸收NaCl和水的量。本实验结果显示，肺气虚模型组大鼠排出尿量明显减少、尿比重升高的同时，肾小管ENaC以及rBSCl表达明显上调。该结果表明，肺气虚状态下可由于肾小管ENaC表达上调促进了Na+重吸收，并带动了Cl-及h3O的重吸收;与此同时，由于rBSCl表达增强，Na+-K+-2Cl-转运速度加快，使肾外髓部小管间隙高渗梯度得以加强，进而促进了水的重吸收。由于二者的共同作用，使水盐重吸收增多而排出尿量减少，增加了水盐在体内的潴留。
根据在充血性心力衰竭状态下，肾脏与肺脏组织上皮细胞的ENaC及rBSCl表达明显上调，认为与肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)被激活有关[2-3]。由肾上腺皮质分泌的ALD经血液进入肾小管上皮细胞后通过基因调节机制生成特异性ADLmRNA，并在胞浆内质网处合成ALD诱导蛋白，后者具有促进管腔膜侧ENaC生成和提高基底侧膜Na+泵活性的作用，由于Na+通道数目增加以及基底侧膜Na+泵的活性增强均加速了Na+重吸收，进而带动了水盐重吸收。ALD对于rBSCl的表达也具有上调作用，由于rBSCl的表达上调能够加速肾小管髓襻升支粗段的NaCl转运，从而加强了肾外髓部间质的高渗梯度，在NaCl重吸收增加的同时水的重吸收增强，二者的共同作用结果增加了机体内水盐的潴留。而ANP则是通过第二信使环磷酸鸟苷途径使肾小管上皮细胞管腔膜上的Na+通道关闭，抑制了Na+的转运，所以其作用是减少了水盐的重吸收，呈现出利尿效果。本实验结果显示，模型组大鼠血浆中ALD水平升高的同时，ANP水平下降，减少了对上皮细胞膜Na+通道的抑制作用，从而从另一方面加强和提高了ALD对Na+的转运功能。
以往的研究发现，包括肺气虚在内的肺部疾病发展到某一阶段多伴有全身体液代谢紊乱，并且血浆中ALD水平多有升高，认为与RAAS功能亢进有关。本实验发现，模型组大鼠血浆与肺组织中ALD含量同时升高，提示肺气虚状态下血浆中ALD上升至少有一部分来自于肺组织。由于肺组织中存在着ALD合成酶[4]，所以具备了合成ALD的条件，其释放ALD详细机制需要进一步证实。
中医理论认为，在机体水液代谢过程中肾主水为其本，肺主行水为其标。肺在水液代谢过程中主要通过其“敷布”与“肃降”功能达到“通调水道”的作用，从而与肾协调完成水液在体内的运行。本实验发现，肺气虚模型大鼠肾小管ENaC和rBSCl蛋白表达上调同时，血浆与肺组织ALD升高而ANP下降，可以认为，正常情况下肺的功能活动除了通过下丘脑-神经垂体或心-肺-肾反射机制等间接影响肾脏尿生成功能外，还可以通过肺组织本身释放生物活性物质经血运直接调控肾小管和集合管的水盐的重吸收功能。由此认为，肺的“通调水道”功能的内涵之一，可能是肺组织通过调节ALD、ANP的释放，进而调控着肾小管上皮细胞ENaC和rBSCl的表达，影响着对水盐的重吸收，调节着尿量变化，达到维系机体水液代谢功能的正常。
参考文献
[1] 陈小野.实用中医证候动物模型学[M].北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1993.314.
[2] 朱彤莹，顾 勇，黄国英，等.充血性心力衰竭时肾脏水通道蛋白mRNA表达的改变及意义[J].中华肾脏病杂志，2002，18(6)：438-440.
[3] 朱彤莹，顾 勇，黄国英，等.充血性心力衰竭大鼠肺脏通道蛋白的表达[J].复旦学报(医学版)，2004，31(3)：239-241.
[4] Wu P， Guo Z， Zhang Y， et al. Aldosterone overproducion and CYP11B2mRNA overexpression in vessles of spontaneously hypertensive rats[J]. Horm Res，1998，50(1)：28-31.