【摘要】 目的 研究大麻素WIN55，212-2对体外培养的牛眼小梁细胞前列腺素E2(PGE2)表达的影响，从而探讨其降眼压机制。方法 采用组织块培养法对牛眼小梁细胞进行原代培养，取传3代的细胞运用酶联免疫吸附(ELISA)法测定不同浓度大麻素WIN55，212-2作用后细胞上清液中PGE2水平的变化;运用RT-PCR方法检测不同浓度大麻素WIN55，212-2作用后PGE2 mRNA在小梁细胞内的表达水平。结果 细胞上清液中的PGE2水平与细胞内PGE2 mRNA水平随大麻素浓度变化呈剂量依赖性升高。结论 一定剂量的大麻素可以促进小梁细胞分泌PGE2，从而达到降低眼压的目的。
【关键词】 大麻素WIN55，212-2;小梁细胞;前列腺素E2;前列腺素E2 mRNA
Abstract：Objective To study the effect of WIN55，212-2 on the expression of PGE2 in cultured bovine trabecular meshwork cells (TMCs) and discuss its mechanism of reducing the intraocular pressure. Methods TMCs were obtained through the cultured tissue， bovine TMCs were prmiarily cultured and subcultured. The third generation bovine TMCs were incubated with different dosages of WIN55，212-2 and the supernatant was collected. The concentration of PGE2 in the medium was measured by ELISA method. PGE2mRNA in TMCs was analyzed by RT-PCR. Result PGE2 in the supernatant and PGE2mRNA in TMCs increased depending on the dosages of WIN55，212-2. Conclusion Certain concentration of WIN55，212-2 may promote PGE2 secretion of TMCs， so as to reduce the intraocular pressure.
Key words：WIN55，212-2;trabecular meshwork cell;PGE2;PGE2 mRNA
大麻素是包括从大麻植物中提取的、人工合成的以及存在于动物体内的内源性大麻素样物质在内的一类具有生物学活性的物质，很早以前就有使用大麻素的天然提取物治疗疼痛、精神病、破伤风等疾病的记载[1]。近年的研究表明，大麻素WIN55，212-2局部应用具有明显的降低眼压作用[2]，而内源性的大麻素N-花生四氢酸氨基乙醇(anandamide，AEA)已经被证实可以促进前列腺素(PG)生成从而起到降低眼压的作用[3]。但目前大麻素WIN55，212-2的降眼压机制尚不清楚。为此，本实验选用大麻素WIN55，212-2作用于牛眼小梁细胞，运用酶联免疫吸附(ELISA)、RT-PCR方法检测不同浓度的大麻素作用后小梁细胞上清液中前列腺素E2(PGE2)水平及小梁细胞内PGE2 mRNA表达水平的变化，探讨大麻素WIN55，212-2的降低眼压机制。
1 实验材料
1.1 主要试剂及药物
大麻素WIN55，212-2及TocrisolveTM 100溶剂(上海优宁维生物科技有限公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程公司)，神经元烯醇化酶(NSE)、波形蛋白及第Ⅷ因子相关抗原、PGE2-ELISA试剂盒(美国R&&D公司)。
1.2 标本的采集
牛眼4只(出生24 h内的小牛处死后于4 h内取小梁组织)。
2 实验方法
2.1 体外牛眼小梁细胞的培养
参考文献
[4]细胞培养方法，牛眼用0.1%新洁尔灭、自来水和60%酒精冲洗消毒后置于无菌D-Hank’s中，在超净工作台中剪除角巩膜缘后3～5 mm的球后组织，分离眼前节，保留完整虹膜组织，置于含少量D-Hank’s液的无菌培养皿中，在体视显微镜下分离小梁组织(乳白色疏松网状组织)。将组织块在无菌D-Hank’s中漂洗3次后，用含青霉素500 U/mL和链霉素500 U/mL的生理盐水浸泡消毒3次，然后用眼科剪将其剪成1 mm大小的碎块并将其移入培养瓶，组织块间距为3～5 mm。将培养瓶倒置放于CO2恒温培养箱，加入高糖型DMEM培养液12 h后翻转培养瓶。每3 d更换培养液，待细胞长满约80%培养瓶底时以1/2方式传代。显微镜观察细胞生长特性及形态特征，从形态学角度初步鉴定细胞。2.2 牛眼小梁细胞的鉴定
5～7 d开始有细胞从组织块周围爬出，细胞开始生长缓慢，以后生长加快。原代细胞从组织块中生长出来形态各异：圆形、三角形、梭形，与相邻细胞的突起彼此相连呈桥状。汇合后细胞形态为少数成纤维细胞型和多数上皮细胞型。传代细胞与原代细胞形态一致。取第3代细胞接种于预置消毒盖玻片的6孔培养板内，细胞贴壁生长1～2 d后，常规PBS缓冲液冲洗， 70%的冷乙醇溶液在-21 ℃固定，用于免疫组化鉴定。实验所培养的细胞神经特异性烯醇化酶(NSE)表达阳性，波形蛋白表达阳性，第Ⅷ因子相关抗原表达阴性，证实所培养小梁细胞的神经嵴间充质起源。与贺氏等[5]的报道一致。结合对所培养细胞生长过程的形态学观察，证明本实验所培养细胞为牛眼小梁细胞。
2.3 ELISA法测定小梁细胞上清液中前列腺素E2浓度
取传3代小梁细胞，经消化离心后按1×104个/mL的密度接种于96孔板中，待细胞融合后，用无血清培养液培养6 h，使细胞状态尽量达到同步化。将细胞随机分为7组，每组10个复孔，分别施加含大麻素WIN55，212-2终浓度为0、0.1、1、10、20、40、60 ?mol/L的不含血清培养液。培养24 h后吸出对应孔中的细胞上清液分装于EP管中，-20 ℃保存待测.并在倒置显微镜下观察细胞的形态特征。按ELISA试剂盒操作说明检测不同浓度大麻素WIN55，212-2作用下细胞上清液液中PGE2的浓度。
2.4 RT-PCR测定细胞内前列腺素E2 mRNA的表达
提取各组细胞的mRNA，反转录获得cDNA。以获得的cDNA为模板，PCR扩增目的基因。扩增条件：94 ℃变性，20 s。58 ℃退火，20 s。72 ℃引物延伸，20 s。32次循环。根据牛的PGE2 mRNA序列(Genebank Accession Number：XP_599033.2)设计引物。PGE2引物序列：上游序列5’-agtgagctgagcctcgtgat-3’，下游序列5’-gcagcagacgtccagtgtta-3’，扩增后片段长度为195 bp。内参β-actin上游序列5’-ctcttccagccttccttcct-3’，下游序列5’-gggcagtgatctctttctgc-3’，扩增后片段长度为178 bp。最后，各取5 ?L PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶中电泳，DNA Marker长度分别为100、250、500、750、1 000、
2 000 bp。
3 统计学方法
所有数据应用SPSS12.0统计软件处理，计量资料结果以—(—资)±s表示，多个样本均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P&<0.05认为有统计学意义。
4 结果
4.1 小梁细胞上清液中前列腺素E2检测结果(见表1)表1 大麻素WIN55，212-2作用24 h后PGE2吸光度的变化(—(—度)±s)注：与空白组比较，*P&<0.01(下同)
4.2 小梁细胞上清液中前列腺素E2 mRNA检测结果(见表2、图1)表2 各组PGE2/β-actin值的比较(—(—比)±s)注：A.空白组;B～G.大麻素各浓度组
图1 PGE2 mRNA在牛眼小梁细胞的表达
4.3 大麻素WIN55，212-2作用后小梁细胞形态变化
大麻素WIN55，212-2作用24 h倒置显微镜下观察发现，随着大麻素浓度的升高，牛眼小梁细胞变圆，细胞突起减少，细胞间隙扩大。
5 讨论
绝大多数青光眼是房水外流阻力增加所致。研究表明，小梁细胞的形态、收缩状态、细胞和细胞外基质(ECM)及细胞之间的粘附性以及细胞骨架结构均参与房水外流的调节，并不同程度地影响眼压值的变化。ECM的降解以及细胞间粘附性的下降会增加房水外流的通畅性。
本实验通过对基因和蛋白两个水平的检测均证实大麻素WIN55，212-2可以促进小梁细胞释放PGE2。前列腺素衍生物已被应用于临床且具有良好的降眼压效果(在一些发达国家已经成为治疗青光眼的一线药物)，其作用机制主要是通过作用于睫状肌和巩膜-葡萄膜通道的基质金属蛋白酶(MMP)，造成睫状肌松弛，肌间隙增宽;同时MMP活性增加可降解ECM，导致房水经巩膜-葡萄膜通道的外流增加和眼压的降低[6-7]。PGE2有4种受体，分别为EP1、EP2、EP3、EP4。有研究发现，有些PGE2(如比马前列腺素及乌诺前列酮)也可能是通过作用于传统房水流出通道(小梁网通道)来降低眼压的[8]。
我们通过相差倒置显微镜观察，发现随着大麻素浓度的升高，牛眼小梁细胞变圆，细胞连接减少，细胞间隙扩大并呈浓度依赖性。我们推测，大麻素WIN55，212-2的降眼压机制还可能是通过改变与细胞形态、运动、细胞及ECM连接粘附等功能密切相关的细胞骨架结构来发挥作用的。小梁细胞骨架改变可以使整个小梁通道的整体结构发生改变，从而使潜在的房水排出通道开放，增加房水外流。
本实验从PGE2的角度对大麻素WIN55，212-2的降压机制进行研究，但是，小梁细胞形态变化的机制、形态变化与PGE2的释放是否有关、WIN55，212-2是否存在其他的降眼压机制目前均不清楚，有待进一步研究。相信随着研究的深入一定会对开发治疗青光眼药物提供新的途径。
参考文献
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