作者：李晶，李娜，刘亚娴，卢付河，付晓梅
【摘要】 目的 观察启膈方对人胃癌MGC细胞增殖能力、运动能力及分泌基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9活性的抑制作用。方法 体外培养人胃癌MGC细胞，随机分为启膈方小、中、大剂量组及5-氟尿嘧啶(5-FU)组、空白对照组，共5组。启膈方小、中、大剂量组加入不同浓度的中药，其终浓度为35、70、140 mg/mL;5-FU组加入5-FU使其终浓度为50 ?g/mL，空白对照组加入PBS。分别用MTT法检测肿瘤细胞的增殖，琼脂滴法检测肿瘤细胞运动能力，明胶酶谱法检测肿瘤细胞分泌MMP-2、MMP-9的活性。结果 启膈方对MGC细胞体外增殖有明显的抑制作用，并随着药物浓度增加其抑制作用更加明显。启膈方各剂量组、5-Fu组运动能力较对照组明显弱，运动速度慢，差异有统计学意义(P&<0.05)。启膈方各剂量组细胞分泌MMP-2、MMP-9活性明显较空白对照组减弱(P&<0.05)，其中MMP-2活性减弱更明显(P&<0.01)。结论 启膈方可通过抑制MGC肿瘤细胞的增殖、运动能力及MMP-2、MMP-9的活性来抑制转移。
【关键词】 启膈方;细胞培养;细胞增殖;细胞运动;基质金属蛋白酶-2;基质金属蛋白酶-9
Abstract：Objective To observe the inhibitory action of Qigefang on cell proliferation， movement， secreting MMP-2 and MMP-9 of MGC gastric cancer cell line. Methods MGC cell line of gastric cancer was cultured and pided into five groups randomly：low-， middle-， high-dose group of Qigefang， 5-FU group， control group. Qigefang was added in Qigefang group to make final concentration of 35， 70， 140 mg/mL， 5-FU in chemothapy group to 50 ?g/mL， and PBS in control group. Tumor cell proliferation was detected by MTT， moving ablity of tumor cell by agar drop， and MMP-2， MMP-9 activity by gelatinase zymography. Results Qigefang had obviously depressant effect on proliferation of MGC cell. It became more obviously with raising drug density. Moving ability of all dose Qigefang groups and 5-FU group were more feeble than control group. The difference was significant (P&<0.05). Activity of MMP-2 and MMP-9 in all dose Qigefang group was weaker than control group (P&<0.05)， especially the activity of MMP-2 (P&<0.01). Conclusion Qigefang can inhibit metastasis of MGC cell by inhibiting its function of proliferation， movement， secreting MMP-2 and MMP-9.
Key words：Qigefang;cell culture;cell proliferation;cell movement;MMP-2;MMP-9
胃癌发生转移是一个极其复杂的多基因调控和多步骤发生过程，涉及癌细胞增殖、细胞粘附、基质降解、细胞迁移等许多环节[1]。胃癌就其临床表现可归属于中医的“噎膈”、“反胃”等范畴，本研究将《医学心悟》中治疗噎嗝的启膈散化裁而成启膈方，体外作用于胃癌MGC细胞，从细胞增殖、运动、分泌降解酶3个方面，来探讨启膈方抗胃癌转移的作用机制和环节。
1 实验材料
1.1 药物、试剂与仪器
启膈方中药材(郁金、丹参、浙贝母、沙参、全蝎、山慈姑等)购于石家庄乐仁堂大药房，经本院制剂室加工成无菌口服液，每毫升含原药材1.5 g，调pH=7.2。 5-氟尿嘧啶(5-FU)，上海旭东海普药业生产，用无菌蒸馏水稀释成1 mg/mL。1640培养基(GibcqBrl公司)，噻唑兰(MTT，美国Sigma公司)，琼脂糖(美国Sigma公司)，丙烯酰胺(美国Sigma公司)。CO2孵箱(上海力申科学仪器有限公司)，倒置相差显微镜(日本Olympus)，电泳仪DF-Cu型(北京东方特力科贸中心)，酶联免疫检测仪(奥地利Anthos Labtec Instruments公司)，凝胶成像分析系统(FOTODYNE，美国Image公司)。
1.2 细胞株
MGC人胃癌细胞株由河北医科大学第四医院科研中心提供。
2 实验方法
2.1 MTT法
参照文献[2]，在96孔板上每孔加入细胞悬液100 ?L，细胞数为2×103，分为启膈方组、5-FU组和空白对照组。启膈方组分别加入启膈方，使其终浓度为35、70、140 mg/mL，定为小、中、大剂量组;5-FU组加5-FU，使其终浓度为50 ?g/mL;空白对照组加入PBS。每块板设不加药的肿瘤细胞对照组和无细胞的空白对照组，每组设6个复孔。培养板放在37 ℃、5%CO2的培养箱中孵育24、48、72 h，培养结束前4 h，每孔加入MTT (5 mg/mL)20 ?L，孵育6 h，吸出培养液，加入DMSO 200 ?L。将培养板震荡5 min后，在自动酶标仪吸收波长490 nm条件下测定吸光度OD值。根据公式计算肿瘤细胞生长的抑制率。
抑制率(%)=(对照孔测定的平均OD值-药物组的平均OD值)/对照孔测定的平均OD值×100%
2.2 琼脂滴法
参照文献[3]，将对数生长期的MGC细胞调整细胞浓度为1×107/mL个细胞，取10 mL，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入100 ?L RPMI1640培养液重新悬浮，在已制备好的肿瘤细胞悬液中加入16.7 ?L，2%的琼脂糖混匀，制成0.3% 琼脂糖肿瘤细胞悬液。用加样器将琼脂糖肿瘤细胞悬液滴入24孔培养板，每孔100 ?L，置于40 ℃ 30 min，使琼脂糖冷却凝固，加PRMI1640培养基，在倒置显微镜下测出基础半径(R’)作为基数。然后分别在启膈方组加入启膈方，终浓度分别为35、70、140 mg/mL，定为小、中、大剂量组;在对照组加入PBS;在5-FU组加入5-FU，终浓度为50 ?g/mL。每组设4个复孔。将培养板置于37 ℃、5%CO2培养箱培养12、24、48、72 h，分别测量肿瘤细胞琼脂滴8个方位的半径(R)，计算平均值，然后根据公式计算各组肿瘤细胞移动速度：V=R-R’/T(h)。
2.3 明胶酶谱法
参照文献[4]，待细胞呈对数生长期时，随机分为5组(同前)。各组细胞培养液均不含血清。培养24 h后，离心去除细胞，取上清液10 ?L，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳完毕后将胶置于2.5% Triton X-100溶液中室温摇洗2次，每次15 min，加入反应液[50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)，150 mmol/L NaCl， 10 mmol/L CaCl2，0.02%NaN3] 37 ℃孵育过夜。取出凝胶进行考马斯亮蓝染色并脱色，结果用Iamgemaster进行拍照，结果分析采用Quantity one软件进行密度扫描分析。基质金属蛋白酶(MMP)活性表现为深色背景中的白色或浅色条带。其中相对分子量92 kD为MMP-9酶原相应条带，72 kD为MMP-2酶原相应条带，凝胶照相后进行灰度分析以评估MMP酶的活性。
3 统计学方法
检测结果用SPSS13.0统计软件进行方差分析，所测数据以—(—数)±s表示，P&<0.05为差异有统计学意义。
4 结果
(见表1～表3) 表1 各组不同时点MGC细胞增殖比较(—(—增)±s)注：与空白对照组比较，*P&<0.05，**P&<0.01(下同)表2 各组不同时点MGC细胞运动能力比较(—(—运)±s)表3 各组MGC细胞分泌MMP活性比较(—(—比)±s)
5 讨论
肿瘤细胞增殖使瘤体不断长大，进而发生转移。抑制肿瘤细胞增殖是控制肿瘤生长、防止转移的重要环节[5]。本实验采用MTT法检测体外培养的胃癌MGC细胞的增殖能力及药物干预后细胞增殖的变化、结果显示启膈方有显著的抑制MGC增殖的作用，随着药物浓度的增加其抑制作用越明显，启膈方大剂量组与5-FU组之间差异无统计学意义。启膈方作用于肿瘤细胞后出现与5-FU组类似的形态学改变，考虑与方中的毒性成分山慈菇、全蝎有关。山慈菇性寒、味甘、微辛，有小毒，有化痰散结、解毒消肿功效。全蝎咸、辛、平，有毒，有消肿散结、熄风解痉、镇静止痛的功效。宗氏等[6]报道，蝎毒作用于人食管癌细胞株后，使其DNA含量显著降低，并可阻止G1期向S期的进程。
肿瘤长到一定大小，肿瘤细胞脱离母体，进行迁徙运动，开始进入转移的过程，因此，肿瘤发生转移离不开肿瘤细胞的运动，运动能力是决定是否转移的一个重要因素。本实验运用琼脂滴法检测肿瘤细胞的运动能力，利用琼脂液可以凝固的特点，可将肿瘤细胞固定于一定位置，并可向周围全方位移动，根据其运动的距离和时间计算其运动速度，来评估肿瘤细胞的运动能力。在培养箱中培养12 h，启膈方各剂量组、5-FU组及对照组运动活性均较弱，各组运动速率未见差别。培养24 h，对照组显示明显的运动活性，其运动速度明显快于启膈方各组及5-FU组。5-FU组运动速度快于启膈方各剂量组。启膈方可抑制肿瘤细胞的运动，5-FU组虽对MGC细胞的运动有抑制，但较启膈方的抑制作用弱。张氏等[7]用Boyden小室法检测丹参酮对肺腺癌PA细胞的侵袭运动能力影响，显示丹参酮可显著抑制PA细胞的运动能力。启膈方对MGC细胞的运动抑制考虑可能与丹参酮有关。
细胞外基质(ECM)是细胞生存的重要内环境，不仅由胶原、糖蛋白、蛋白多糖等构成，而且含有大量的蛋白酶、细胞因子、粘附分子;尤其是其中的基底膜，是肿瘤转移过程中必须克服的生理屏障[8]。大量研究表明，MMP是降解ECM最重要的酶类。MMP-2、MMP-9属于基质金属蛋白酶家族中Ⅳ型胶原酶，其主要作用是水解变性的胶原及细胞外基质的主要成分Ⅳ型胶原、V型胶原[9]，为肿瘤细胞清除细胞外基质的主要屏障。本实验运用明胶酶谱法检测及MGC肿瘤细胞分泌MMP-2、MMP-9活性显示，MGC细胞均可分泌两种明胶酶且有较高的活性。通过启膈方干预后MGC肿瘤细胞分泌MMP-2、MMP-9的活性明显减弱，各剂量组之间差异无统计学意义。5-FU组中MGC肿瘤细胞分泌MMP-2、MMP-9的活性也较空白对照组弱，但抑制率仍低于启膈方组(P&<0.05)。由此我们认为，启膈方抑制MMP-2、MMP-9的活性，阻碍MMP-2、MMP-9对基质的降解，从而阻止转移过程。
启膈方由《医学心悟》中治疗噎嗝的启膈散化裁而成，方中沙参、郁金甘润濡养、益胃生津、理气活血，可滋润干槁之胃脘，调理阻滞之气机，共为君药;茯苓、浙贝母、砂仁化痰散结、理气和中共为臣药;山慈菇、全蝎散结通络、化痰软坚为佐药;荷叶、浮小麦醒脾开胃为使。本研究从启膈方对细胞增殖、运动、降解3个方面的影响，探讨其抑制转移的机制，为其在临床进一步应用提供客观依据。
参考文献
[1] Mahmut Yilmaz， Gerhard Christofori， Francois Lehembre. Distinct mechanisms of tumor invasion and metastasis[J]. Trends in Molecular Medicine，2007，13(12)：535-540.
[2] 薛晓鸥，曹 爽，魏丽惠.金雀黄素对离体人子宫肌瘤细胞增殖的影响[J].中国中药杂志，2004，29(12)：1177-1179.
[3] 高 进，章静波.癌的侵袭与转移：基础与临床[M].北京：科学出版社， 2003.239.
[4] 司徒镇强，吴正军.细胞培养[M].北京：世界图书出版社，2004.50-251.
[5] Townson JL， Naumov GN， Chambers AF. The role of apoptosis in tumor progression and metastsis[J]. Curr Mol Med，2003，3：631-642.
[6] 宗安民，田爱琴，赵培荣，等.马氏钳蝎蝎毒对人食管癌细胞株作用的流式细胞光度术分析[J].中华肿瘤杂志，1994，16(5)：344.
[7] 张培彤，裴迎霞，祁 鑫，等.活血药对人肺癌细胞粘附和侵袭的影响[J].中国西医结合">中西医结合杂志，1999，19(2)：103-105.
[8] Tian B， Li Y， Ji XN， et al. Basement membrane proteins play an active role in the invasive process of human hepatocellular carcinoma cells with high metastasis potential[J]. J Cancer Res Clin Oricol，2005，131(2)：80-86.
[9] 汪丽燕，乔 镇，关景明.基质金属蛋白酶与其抑制剂在消化道肿瘤中的研究进展[J].世界华人消化杂志，2004，12(11)：2674-2678.