作者：张凌，刘亚丽，张翔，李慧
【摘要】 目的 建立常春油麻藤中刺芒柄花素的提取方法。方法 采用正交试验对刺芒柄花素的提取条件进行相关研究。结果 甲醇作为提取溶剂，料液比1∶40(g∶mL)，85 ℃回流提取3次，每次1.5 h，常春油麻藤中刺芒柄花素含量为0.038 12%。结论 本研究优化确定了常春油麻藤中刺芒柄花素的提取方法。
【关键词】 常春油麻藤;刺芒柄花素;提取工艺
Abstract：Objective To establish the method of extraction and separation of formononetin in Mucuna sempervirens Hemsl.. Methods The extraction and separation conditions of formononetin was studied by orthogonal test. Results Solid-liquid ratio was 1∶40 (g∶mL)， with methanol refluxing and extracting for 3 times at 85 ℃， 1.5 h once， the content of formononetin was 0.038 12%. Conclusion The optimal parameters for extraction and separation condition of formononetin in Mucuna sempervirens Hemsl. was established.
Key words：Mucuna sempervirens Hemsl.;formononetin;extraction process
常春油麻藤为豆科(Leguminosae)藜豆属(Mucuna)植物常春油麻藤(Mucuna sempervirens Hemsl.)的干燥藤茎，常作鸡血藤入药，具行血补血、通经活络的功效。民间长期使用表明，该药通经活络、补血作用类似鸡血藤，但侧重于滋补强壮而不腻，且口感优于鸡血藤[1]。目前，关于常春油麻藤中异黄酮类成分的相关研究，尤其是其中刺芒柄花素的提取研究未见报道。本研究以异黄酮类成分刺芒柄花素的含量为指标[2-3]，采用正交试验优选常春油麻藤中刺芒柄花素的提取条件。
1 仪器与试药
Agilent1200型高效液相色谱仪，VWD检测器(美国安捷伦公司);Galanz WP800TL23-K3型微波炉(格兰仕集团有限公司)。
刺芒柄花素对照品(上海康九化工有限公司，批号060916，质量分数≥98%);常春油麻藤药材采自南昌梅岭山脉(2006年10月)，江西中医学院赖学文副教授鉴定，标本存于江西中医学院标本室。甲醇为色谱纯;水为双蒸水;其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 含量测定
2.1.1 色谱条件 Hypersil ODS-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 ?m);检测波长：249 nm;柱温：25 ℃;流动相：甲醇-水(55∶45);流速：1.0 mL/min;进样量：10 ?L。
2.1.2 对照品溶液制备 精密称取8.02 mg刺芒柄花素对照品，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为160.4 ?g/mL刺芒柄花素对照品溶液，备用。
2.1.3 供试品溶液制备 精密称取2.0 g常春油麻藤药材粉末，置于100 mL圆底烧瓶中，按正交试验设计提取工艺，甲醇为提取溶剂，水浴加热回流，滤液浓缩至50 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，经0.45 ?m微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。
2.1.4 方法专属性考察 在上述色谱条件下，常春油麻藤中其他成分不干扰刺芒柄花素的测定，在该色谱条件下保留时间为12.51 min，色谱图见图1。
A B
注：A.对照品;B.样品;1.刺芒柄花素
图1 常春油麻藤HPLC图谱
2.1.5 标准曲线绘制 精密吸取刺芒柄花素对照品溶液，分别配制成1.604、3.208、6.416、16.04、32.08、80.2、160.4 ?g/mL系列浓度的溶液。按上述色谱条件测定，得线性回归方程：C=0.016 3A+0.334 6，r=0.999 9，刺芒柄花素在1.604～160.4 ?g/mL范围内线性关系良好。
2.1.6 精密度、稳定性和重复性考察 取同一供试品溶液，连续进样6次，测定刺芒柄花素峰面积，RSD=0.57%，说明精密度良好。取同一供试品溶液，分别在0、0.5、1、2、4、8、12 h分别测得刺芒柄花素峰面积，测得峰面积的RSD=1.8%，说明样品溶液在12 h内稳定。取同一批样品6份，按照供试品溶液制备方法制备并测定，测得刺芒柄花素的平均含量为0.038 23%， RSD=1.24%(n=6)。
2.1.7 加样回收率试验 精密称取2.0 g已知含量的常春油麻藤粉末，分别加入刺芒柄花素对照品适量，按照供试品溶液制备方法制备并测定。刺芒柄花素平均回收率为99.00%，RSD=0.85%，表明方法的回收率良好。
2.2 提取条件
2.2.1 正交试验因素和水平设计 以提取时间、料液比及提取次数为考察因素，每个因素选择3个水平，以刺芒柄花素含量为指标，编制L9(34)因素水平表，见表1。表1 L9(34)因素水平表
2.2.2 正交试验结果 以每克药材中刺芒柄花素含量为指标，正交试验结果见表2，其显著性检验见表3。表2 L9(34)正交试验结果
用直观分析法得出常春油麻藤中刺芒柄花素的提取影响因素为C&>B&>A，根据R值可以得出最佳工艺A2B3C3，即：料液比为1∶40(g∶mL)，提取时间1.5 h，分3次、每次0.5 h，用甲醇加热回流提取。表3 刺芒柄花素含量方差分析
刺芒柄花素校正模型统计量F=1.395，所选模型有统计学意义，其中因素A、B、C的P&>0.05，说明所选因素对试验结果的差异没有统计学意义。
2.2.3 验证试验 根据正交试验得出刺芒柄花素最佳提取工艺A2B3C3进行样品制备，测定刺芒柄花素含量为0.038 12%，证实A2B3C3为最佳提取工艺。
3 讨论
在提取工艺研究中，预试验进行了提取方法和提取溶剂单因素优选试验：分别采用微波、加热回流、索氏、超声、冻融5种提取方法，结果回流提取法效果最佳;采用甲醇、甲醇-氯仿(3∶1)、甲醇-氯仿(1∶1)、甲醇-氯仿(1∶3)、氯仿5种提取溶剂，结果甲醇为提取溶剂效果最佳。
在单因素考察基础上，采用正交试验对常春油麻藤中刺芒柄花素的提取条件进行优选，正交试验结果根据直观分析法，最后得出影响因素为C&>B&>A，根据R值可以得出最佳工艺为A2B3C3，即：料液比1∶40(g∶mL)，提取时间1.5 h(分3次，每次0.5 h)，甲醇加热回流提取，刺芒柄花素含量为0.038 12%;另对试验结果用SPSS软件进行方差分析，发现3个因素(提取时间、料液比与提取次数)在统计学意义上对结果没有显著影响，其主要原因可能是因素设定不够合理，而各个水平之间差异又较小。今后尚需进一步完善。
参考文献
[1] 卫爱黎.常春油麻藤的显微观察及成分初探[J].中国民族民间医药杂志，1999，8(6)：351-353.
[2] 边宝林，王宏洁，司 南.鸡血藤药材中表儿茶素的含量测定[J].中国实验方剂学杂志，2004，10(6)：31-33.
[3] 严启新，李 萍.鸡血藤高效液相色谱指纹图谱研究[J].中草药，2004， 35(5)：556-559.