作者：樊永平，宋丽君，叶明，周莉，龚海洋，王蕾，刘妍
【摘要】 目的 通过观察左归丸与右归丸对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型大鼠脑、脊髓组织淋巴细胞亚群免疫组化表达的影响，探讨滋阴补肾法与温阳补肾法治疗EAE作用机制。方法 应用髓鞘碱性蛋白与完全福氏佐剂，按体积比1∶1制成抗原并于Lewis大鼠双后足垫下注射，建立EAE模型。120只Lewis大鼠随机分为正常组、模型组、激素组、左归丸组及右归丸组，每组24只，正常组和模型组给予生理盐水灌胃，3 mL/(只·d);激素组免疫后给予生理盐水灌胃，3 mL/(只·d)，发病后改为醋酸泼尼松混悬液灌胃，5 mg/(kg·d);左归丸组免疫后给予左归丸混悬液，2 g/(kg·d);右归丸组免疫后给予右归丸混悬液，3 g/(kg·d)。直至处死。分别于急性期(免疫后15 d)和缓解期(免疫后27 d)随机选取各组大鼠，取脑和脊髓组织切片进行CD4+、CD8+、CD3+、CD19+免疫组化染色。结果 造模后第15日及第27日，模型组脑和脊髓组织中CD4+免疫组化表达均较正常组升高(P&<0.01)，CD8+表达降低(P&<0.05)，CD4+/CD8+比值升高(P&<0.01);同模型组比较，左归丸组、右归丸组、激素组CD4+免疫组化表达均降低(P&<0.01)，且在造模后第27 日，左归丸组和右归丸组脊髓组织CD4+表达较激素组显著降低(P&<0.01);造模后第15日，右归丸组和激素组CD8+表达较模型组升高(P&<0.01)，造模后第27日，左归丸组和激素组CD8+表达较模型组升高(P&<0.01);不同时点激素组、左归丸组及右归丸组CD4+/CD8+比值均显著低于模型组(P&<0.05);造模后第15日及第27日，模型组中枢神经系统CD19+免疫组化表达均较正常组升高(P&<0.01)，急性期左归丸组、右归丸组、激素组脊髓组织CD19+表达较模型组降低(P&<0.01)，缓解期则见左归丸组和右归丸组CD19+表达减少(P&<0.01)。结论 EAE大鼠CD4+/CD8+比值升高，这在EAE发病中发挥重要作用。滋阴补肾法和温阳补肾法可下调CD4+表达，下调CD4+/CD8+比值来治疗EAE。
【关键词】 实验性自身免疫性脑脊髓炎;左归丸;右归丸;多发性硬化
Abstract：Objective To observe the immunohistochemical expression of lymphocyte subpopulationin in brain and spinal cord tissue， and explore the mechanism of Zuogui wan and Yougui wan on rats with experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Methods Lewis rats were immunized with the myelin basic protein (MBP). 120 rats were grouping randomly into normal group， EAE group， prednisone group， Zuoguiwan group and Youguiwan group after post immunization (PI). Rats in normal group and EAE group were administered normal soline， each 3 mL/d. Rats in prednisone group were administered suspension of prednisone after developed clinical signs， each 5 mg/kg. Rats in Zuoguiwan group were administered suspension of Zuoguiwan， each 2 g/kg， and rats in Youguiwan group were administered suspension of Youguiwan， each 3 g/kg. On 15th and 27th day after PI， rats were killed and the immunohistochemical staining was performed on the sections of brain and spinal cord. Results On 15th and 27th day after PI， the expression of CD4+ in brain and spinal cord tissue of EAE group were significantly higher than that in normal group (P&<0.01)， while the expression of CD8+ was significantly lower than normal group (P&<0.05)， CD4+/CD8+ was significantly lower too (P&<0.01). Compared with EAE group， the expression of CD4+ in prednisone group， Zuoguiwan group and Youguiwan group were significantly lower (P&<0.01). On 27th day after PI， the expression of CD4+ in spinal cord tissue of Zuoguiwan group and Youguiwan group were significantly lower than that on 15th day after PI (P&<0.01). On 15th day after PI， the expression of CD8+ in prednisone group and Youguiwan group were significantly higher than that in EAE group (P&<0.01)， while on 27th day after PI， the expression of CD8+ in prednisone group and Zuoguiwan group were higher than that in EAE group (P&<0.01). On both points， CD4+/CD8+ in prednisone group， Zuoguiwan group and Youguiwan group were significantly lower than EAE group (P&<0.05). On 15th and 27th day after PI， the expression of CD19+ in brain and spinal cord tissue of EAE group were significantly higherthan that in normal group (P&<0.01). In acute stage， the expression of CD19+ in spinal cord tissue of prednisone group， Zuoguiwan group and Youguiwan group were significantly lower than that in EAE group (P&<0.01). In chronic phase， the expression of CD19+ in spinal cord tissue of Zuoguiwan group and Youguiwan group were significantly lower than EAE group (P&<0.01). Conclusion Zuoguiwan and Youguiwan both have the effect of down-regulating the immunohistochemical expression of CD4+ in central nervous system of EAE rats， the down-regulation of CD4+/CD8+ may be the mechanism for the method of nourishing yin and invigorating yang.
Key words：experimental autoimmune encephalomyelitis;Zuoguiwan;Youguiwan;multiple sclerosis
多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是一种慢性自身免疫性中枢神经系统疾病，病理特点为病灶区域的血脑屏障(blood brain barrier，BBB)损害、炎症和髓鞘脱失。细胞免疫调节异常在其发生和发展中起重要作用[1-2]。虽然实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis， EAE)动物模型在临床和病理方面上与MS有许多相似之处，但是EAE由髓鞘碱性蛋白(MBP)致敏产生，故抗原是已知的，但MS的致敏抗原仍不明确，发病机制与EAE还不完全一样。典型的MS早期病变，淋巴细胞包括浆细胞未出现在血管周围腔，故可肯定淋巴细胞未直接参与脱髓鞘过程。尽管EAE不能完全代替MS，但对于研究MS病理形成过程、发病机制及观察各种治疗效果仍是有价值的[3]。在前期研究中药二黄方(胶囊)、左归丸、右归丸对EAE大鼠外周血T淋巴细胞影响的基础上[4]，本实验研究左归丸与右归丸对EAE大鼠模型中枢神经系统中淋巴细胞亚群免疫组化表达的影响，探讨滋阴补肾法与温阳补肾法治疗MS的作用机制。
1 材料与方法
1.1 动物
SPF级Lewis大鼠，雄性，体重200～250 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号：SCXK(京)2007-0001]，饲养于首都医科大学实验动物中心国家标准实验室[许可证号：SYXK(京)2005-0022]。
1.2 抗原、药物及试剂
左归丸由熟地黄、山药、山茱萸、枸杞子、鹿角胶、菟丝子、川牛膝和龟胶组成，右归丸由熟地黄、山药、山茱萸、枸杞子、鹿角胶、菟丝子、杜仲、当归、肉桂和附子组成，北京同仁堂制药厂提供;醋酸泼尼松，5 mg/片，批号060802，天津力生制药厂提供;完全福氏佐剂(complete Freund’s adjuvant， CFA)，批号F7881，美国Sigma公司提供;髓鞘碱性蛋白(MBP87-99，human，bovine，rat)由美国ALEXIS生物化学公司提供，批号16752/a;RAT CD4-PE抗体(MR5104)、RAT CD8-TC抗体(MR5206)、RAT NKTR-PE抗体(MR6804)，由美国Caltag公司提供。CD3(批号bs-0550R)、CD4(批号bs-0647R)、CD8(批号bs-0648R)、CD19(批号bs-0079R)免疫组化试剂盒，购于北京博奥森生物技术有限公司。
1.3 造模
将125 ?L MBP87-99水溶液(含MBP87-99150 ?g)与125 ?L CFA混合，充分乳化制成抗原配剂。当天给予Lewis大鼠双后足垫皮下多点注射250 ?L抗原配剂，诱导EAE。对照组则予足垫皮下注射CFA与生理盐水的混合液。
1.4 分组及药物干预
120只Lewis大鼠随即分为5组，每组24只。按组别分别作以下处理：①正常组每日给予生理盐水灌胃(3 mL/只);②模型组免疫后每日给予生理盐水灌胃(3 mL/只);③激素组免疫后每日给予生理盐水灌胃(3 mL/只)，发病后改为醋酸泼尼松混悬液灌胃(5 mg/kg);④左归丸组免疫后每日给予左归丸混悬液灌胃(2 g/kg);⑤右归丸组免疫后每日给予右归丸混悬液灌胃(3 g/kg)。
1.5 取材
分别于造模后第15日(急性期)和第27日(缓解期)处死大鼠取材。用10%的水合氯醛以4 mL/kg的剂量腹腔注射麻醉大鼠，麻醉后，将大鼠仰卧位置于托盘内，打开腹腔，从大鼠肋骨两侧剪断肋骨，打开胸腔，暴露心脏，用钝针经心尖部略左(左心室)进针，插入至主动脉，用止血钳将针头固定好，剪开右心耳，立即用生理盐水冲洗，直至右心耳流出液体清亮，约200～300 mL;关闭灌注泵开关，换为4%多聚甲醛灌注固定，先快后慢，直至大鼠变硬，每只约用多聚甲醛200～300 mL，剥离脑和脊髓，放入4%多聚甲醛液中固定。
1.6 免疫组化染色
按照试剂盒说明书操作。将组织冲洗干净，梯度酒精脱水，二甲苯透明，再以纯净石蜡将脑组织包埋，石蜡切片机做连续切片，片厚5 ?m。石蜡切片脱蜡至水。3%h3O2室温孵育10 min， PBS冲洗5 min，共3次。滴加适当比例稀释的CD4+、CD8+、CD3+、CD19抗体，37 ℃孵育2 h，PBS冲洗5 min，共3次。25 ℃孵育2 h，4 ℃过夜，PBS洗2 min，共3次。滴加生物素标记羊抗兔IgG，室温下20 min，PBS洗2 min，共3次;滴加SABC复合物，室温20 min，PBS洗5 min，共4次。DAB显色10 min左右，蒸馏水多次洗涤，苏木素轻度复染，脱水，透明，中性树胶封片，显微镜下观察。阴性对照不加一抗，以正常山羊血清和PBS代替CD4+、CD8+、CD3+、CD19+抗体作孵育。
1.7 病理图像分析
采用MIAS医学图像分析管理系统对免疫组化染色结果进行定量分析，每组选取3张切片，每张切片在大脑及脊髓白质区域随机选取6个高倍视野(×400)，阳性结果用积分光密度(Integral Optical Density，IOD)表示。
1.8 统计学方法
所有数据均以—(—数)±s表示，采用SPSS11.5软件进行方差分析。
2 结果
(见表1、表2)表1 各组大鼠不同时点脑组织淋巴细胞亚群免疫组化IOD值变化(—(—化)±s，%)注：与正常组比较，*P&<0.05，**P&<0.01;与模型组比较，△P&<0.05，△△P&<0.01;与激素组比较，▲P&<0.05，▲▲&<0.01;与免疫后15 d比较，表2 各组大鼠不同时点脊髓组织淋巴细胞亚群免疫组化IOD值变化(—(—化)±s，%)
3 讨论
MS发病机制尚不完全清楚，目前认为是由于机体免疫调节功能紊乱，造成Ts细胞及NK细胞数量减少和功能缺陷，Th细胞功能相对亢进，最终致B细胞过度活化而产生以抗髓鞘碱性蛋白为主的自身抗体所致[5]。细胞免疫在MS的发病机制中起重要作用，CD4+、CD8+被抗原刺激活化后，可随机进入中枢神经系统形成获得性免疫监视功能[6]。有报道，急性发作期CD8+T细胞和对照组相比下降，这提示MS发作期CD4+/CD8+比值可能升高[7]。Ionen等[8]对25名确诊MS患者的研究表明，MS发作期患者CD8+细胞比例显著下降，CD4+T细胞比例无明显下降，CD4+/CD8+T细胞比例显著增加，均提示在MS发作期可能存在CD4+/CD8+T细胞比例增高[9]。我国学者的研究表明，MS患者外周血中CD8+细胞显著降低，CD4+/CD8+比值明显升高;脑脊液中CD3+、CD4+细胞明显升高，CD8+细胞显著低于对照组及外周血，而CD4+/CD8+比值明显高于对照组及外周血[10]。MS患者脑脊液中CD4+/CD8+高比率，在其经受大剂量甲基强的松龙治疗后，病情趋于缓解，EDSS评分下降后也逐步降低，说明CD4+/CD8+比率是一个较为敏感的指标，可用于MS辅助诊断、病情的动态观察及药物疗效判断等[11]。
左归丸、右归丸是滋补肾阴和温补肾阳法治疗MS的重要代表方剂，我们使用流式细胞仪技术观察左归丸和右归丸对EAE大鼠外周血淋巴细胞亚群水平的影响。结果造模后第15日，左归丸组CD4+细胞显著升高(P&<0.05);模型组CD4+/CD8+比值高于正常组(P=0.052);造模后第27日，模型组CD4+/CD8+比值明显升高(P&<0.05);左归丸组CD4+/CD8+比值明显降低(P&<0.05)[4]。
本实验中，无论是急性期还是缓解期，模型组脑和脊髓组织中CD4+免疫组化表达均较正常组升高(P&<0.01)，CD8+表达降低(P&<0.05)，CD4+/CD8+比值升高(P&<0.01)，与文献报道一致，说明CD4+/CD8+比值失衡在EAE的发病过程中发挥重要作用。在与模型组的比较中，激素组、左归丸组、右归丸组中枢神经系统CD4+免疫组化表达均降低(P&<0.01)，且在缓解期左归丸组和右归丸组脊髓组织中CD4+表达较激素组明显减少(P&<0.01)，均提示左归丸和右归丸可能通过下调CD4+细胞水平来达到防治EAE的作用。CD4+T细胞依据其分泌细胞因子的不同分为两类：Th1和Th3细胞，Th1类细胞因子促进疾病发展，而Th3类细胞因子则促进疾病恢复[12]，左归丸和右归丸可能通过下调Th1类细胞因子促进了EAE的恢复;在对CD8+表达的调节方面，右归丸和激素可提高急性期CD8+表达(P&<0.01)，左归丸组和激素可上调缓解期CD8+表达(P&<0.01);最终，在不同时点激素组、左归丸组及右归丸组CD4+/CD8+比值均显著低于模型组(P&<0.05)，我们认为，这与药物下调了CD4+表达、上调了CD8+表达有关。在急性期及缓解期，均可见模型组CD19+免疫组化表达升高，提示CD19+加剧了EAE的免疫炎性反应，急性期激素组、左归丸组、右归丸组脊髓组织CD19+表达较模型组降低(P&<0.01)，缓解期则见左归丸组和右归丸组CD19+表达减少，说明药物可下调中枢神经系统尤其是脊髓组织中CD19+表达，减轻EAE炎性反应程度。
参考文献
[1] McDonald WI. The mystery of the origin of multiple sclerosis[J]. J Neurol Neurosurg Psychiatry，1986，49：113.
[2] Prineas JW， Barnard RO， Revesz T， et al. Multiple sclerosis：Pathology of recurrent lesions[J]. Brain，1993，116：681.
[3] 袁锦楣.临床神经免疫学[M].北京：北京科学技术出版社，1992.135.
[4] 叶 明，樊永平，王 蕾，等.滋阴补肾法与温阳补肾法对EAE大鼠淋巴细胞亚群和NK细胞的影响[J].中华中医药杂志，2009，24(3)：310-314.
[5] Waksman BH. Current trends in multiple sclerosis research[J]. Immunol Today，1981，1：87-89.
[6] Hichey WF. Migration of hematogenous cells through the blood- brain barrier and the initiation of CNS inflammation[J]. Brainpathol，1991，1(2)：97.
[7] Reder AT， Antel JP， Oger JJ， et al. Low T8 antigen density on lymphocytes in active multiple sclerosis[J]. Ann Neurol，1984， 16(2)：242.
[8] Ionen J， Surcel HM， Jagerroos H， et al. T-Lymphocyte subsets defined by double immunofluorescence in multiple sclerosis[J]. Acta Neurol Scnd，1990，81(2)：128.
[9] Poser CM， Paty DW， Scheinberg L， et al. New diagnostic criteria for multiple sclerosis guidelines for research protocols[J]. Ann Neurol，1983，13(3)：227.
[10] 高 敏，高 聪，杨 宁.地黄合剂对多发性硬化患者外周血及脑脊液中T淋巴细胞亚群的影响[J].中国中医药科技，2005，12(4)：207-208.
[11] Frequin ST， Lamers KJ， Borm GF， et al. T-cell subsets in the cerebrospinal fluid and peripheral blood of multiple sclerosis patients treated with high-dose intravenous methylpredisdone[J]. Acta Neurol Scand，1993，88(2)：80-86.
[12] O’Garra A. Cytokines induce the development of functionally heterogeneous T helper cell subsets[J]. Immunity，1998，8：275-283.