作者：张永锋，吴正治，贾秀琴，谭永港，赵燕萍
【摘要】 目的 探讨健脾化瘀清热代表药(黄芪、丹参、黄连)对胃溃疡愈合质量(QOUH)的影响及作用机制。方法 采用大鼠乙酸胃溃疡模型，观察黄芪、丹参、黄连对该模型QOUH的影响；原位分子杂交法检测表皮生长因子受体(EGFR)mRNA的表达。结果 黄芪、丹参、黄连均能改善胃黏膜组织的损伤，黄芪、丹参能增强溃疡周围组织EGFR mRNA的表达。结论 健脾化瘀清热药提高QOUH、增强溃疡瘢痕处EGFR mRNA的表达可能是健脾化瘀药的作用机制之一。
【关键词】 胃溃疡；健脾化瘀清热药；表皮生长因子；溃疡愈合质量；大鼠
Abstract：Objective To investigate the effect and mechanism of invigorating spleen， eliminating stasis， heat-clearing drugs (milk veteh， root of red rooted salvia， Chinese goldthread) on quality of ulcer healing (QOUH). Methods The rat models of chronic gastric ulcer was induced by acetic acid， the effects of QOUH of milk veteh， root of red rooted salvia and Chinese goldthread on the model of gastric Ulcer were observed， the expression of EGFR mRNA of mucosa were measured by in situ hybridization. Results Milk veteh， root of red rooted salvia and Chinese goldthread could improve the injury of gastric mucosa. Milk veteh， root of red rooted salvia increased the expression of EGFR mRNA in the tissue around peptic ulcer (PU). Conclusion Invigorating spleen， eliminating stasis， heat-clearing drugs can improve QOUH， it is one of possible mechanisms that the drugs increased the expression of EGFR mRNA in the tissue around PU.
Key words：gastric ulcer；invigorating spleen， eliminating stasis， heat-clearing drugs；epidermal growth factor；quality of ulcer healing；rat
根据中医理论，综观消化性溃疡(peptic ulcer，PU)缓解期临床治疗的有关方药，基本属于健脾、化瘀、清热范畴。本实验通过观察健脾化瘀清热代表药(黄芪、丹参、黄连)对大鼠胃溃疡愈合质量(quality of ulcer healing，QOUH)及其表皮生长因子受体(EGFR)mRNA表达的影响，为中医药提高PU远期疗效提供思路与方法。
1 实验材料
1.1 实验动物
SD大鼠90只，雌性，体重180～220 g，广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号：0028062。
1.2 药物与试剂
黄芪、丹参、黄连由深圳市第二人民医院第一门诊部中药房提供，各单味药物置于搪瓷药罐中，以1∶10比例加入蒸馏水浸泡2 h，加热煮沸30 min，滤出头煎，药渣加蒸馏水适量，再煮沸30 min，滤出二煎，合并2次滤液，浓缩成200%，置冰箱中保存。西咪替丁片，江西制药有限责任公司生产，批号990808-1。EGFR mRNA试剂盒，购自武汉博士德生物工程有限公司。
1.3 仪器
显微镜测微尺(武汉光学仪器厂生产)，原位杂交专用盖玻片(博士德公司产品)，杂交盒，S-HH-W型恒温水浴箱(上海浦东跃欣科学仪器厂)，SYQ-ZDX-35BⅠ型自动座式压力蒸气灭菌器(上海申安医疗器械厂)，CMIAS真彩色病理图像分析系统(北京航空航天大学)，Nikon P-Ⅲ显微摄影系统(日本)。
2 实验方法
2.1 造模
参考文献
[1]方法。大鼠造模前24 h禁食不禁水。用20%乌拉坦4 mL/kg体重腹腔注射麻醉。腹部备皮、消毒，于剑突下腹中线打开腹腔，手术切口长约2 cm，暴露出胃，在胃前壁浆膜面窦体交界处同一部位(避开血管)用浸有冰醋酸、直径为5 mm的圆形滤纸接触2次，每次30 s，然后还纳胃体，逐层缝合切口，涂上一层稀释的火棉胶，保护切口。 2.2 分组与给药
造模大鼠清醒后，完全随机分为6组：正常对照组、模型对照组、西咪替丁组、黄芪组(健脾药)、丹参组(化瘀药)及黄连组(清热药)，每组15只。于造模第6天开始灌胃，黄芪、丹参及黄连给药剂量均为20 g/(kg?d)，西咪替丁给药剂量为67 mg/(kg?d)，对照组予0.9% NaCl溶液14.6 mL/(kg?d)。每天1次，共16 d。所有药物溶液及0.9%NaCl溶液pH值均为7.0。于造模第22天断头处死大鼠，检测指标及取材。
2.3 标本的采集和处理
大鼠禁食不禁水24 h后断头处死，剖腹取胃，以溃疡瘢痕平行于胃长轴方向的最长径为中心取材，8%甲醛固定，石蜡包埋，以瘢痕的最长径为中心连续切片，间隔5 μm，分别作苏木素-伊红(HE)染色和AB(pH 2.5)/PAS染色；取溃疡瘢痕周围组织一块，4%多聚甲醛(含DEPC)固定、石蜡包埋、切片，原位分子杂交方法观察EGFR mRNA的表达。
2.4 观察指标
2.4.1 再生黏膜厚度、黏膜肌层缺损宽度[2]
治疗16 d后，药物组肉眼见溃疡基本愈合，在HE染色的连续切片上，用低倍镜找到溃疡愈合部位，在高倍镜下观察测量，用显微镜测微尺分别测5个视野长度，计算其平均值。
2.4.2 表面黏液厚度[2]
在HE染色的切片上找到溃疡愈合部位，在对应的AB/PAS染色的切片上观察，用测微尺分别测5个视野的表面黏液厚度，计算其平均值。
2.4.3 表皮生长因子受体mRNA的表达
实验步骤按试剂盒说明书操作，以细胞胞浆着色呈棕黄色为阳性，计算机图像分析采用北京航空航天大学图像分析中心和空军总医院生物医学工程研究所研制的CMIAS真彩色病理图像分析系统进行，在光镜下(×400)每张切片随机选取5个视野，用“体视学分析”模型作图像分析后，计算平均光密度和平均灰度。
2.5 统计学方法
数据以x±s表示，组间差异性比较采用两样本均数比较的t检验。
3 结果
(见表1、表2)表1 治疗后大鼠再生黏膜厚度、黏膜肌层缺损宽度及黏液厚度(略)注：与模型对照组比较，*P&<0.01；与西咪替丁组比较，△P&<0.05(下同)。表2 黄芪、丹参、黄连对大鼠胃黏膜组织EGFR mRNA表达的影响(略)
4 讨论
PU是临床的常见病、多发病，目前药物治疗近期愈合较好，但停药后仍有较高的复发率，因此PU的治疗应着眼于提高远期疗效，防治复发。
Tarnawski等[3]首先提出了QOUH的概念，认为溃疡的愈合不仅需要黏膜缺失的修复，更需要黏膜下组织结构的修复重建。评价溃疡愈合的情况不仅仅是内镜或直视下对浅表再生黏膜的观察，还应了解黏膜下组织重建的情况。评价QOUH不仅要评价溃疡局部再生黏膜结构成熟度，更应重视其功能成熟度，并以此判定其对未来溃疡复发的影响及评价药物对溃疡的疗效。我们在原来研究的基础上[4]，试图从理、法入手，探讨健脾化瘀清热代表药(黄芪、丹参、黄连)对QOUH的影响，实验结果表明：黄芪、丹参、黄连组再生黏膜厚度增加，黏膜肌层缺损宽度减小，与0.9%NaCl溶液组比较，有非常显著性差异(P&<0.01)，说明黄芪、丹参、黄连能提高再生黏膜组织学成熟度，提高黏膜修复能力。黄芪、丹参、黄连组及西咪替丁组表面黏液厚度均高于生理盐水组(P&<0.01)，且黄芪、丹参、黄连组又高于西咪替丁组(P&<0.01)，说明黄芪、丹参、黄连能促进黏液分泌，其作用优于西咪替丁。
在众多生长因子中，与胃肠道上皮生长、修复有关的因子很多，但目前研究最多、最受重视的仍是表皮生长因子(EGF)及其EGFR。EGF是一种具有抑制胃酸分泌、促进上皮增殖、组织修复和细胞保护作用的内源性物质，在保护胃黏膜免受损伤因子破坏、维持胃肠黏膜完整性方面起着非常重要的作用，是近年发现的在细胞增殖和分化中起重要作用的分子；而生长因子要发挥作用，必须与相应的受体结合。EGFR是一种单链跨细胞膜糖蛋白，对EGF有高度的特异性和亲和力，当EGF到达靶细胞表面时，便很快与细胞膜上EGFR结合，从而发挥其生理功能，促进组织修复、溃疡愈合。实验结果表明，黄芪、丹参增强溃疡周围组织EGFR mRNA的表达，可能是其提高溃疡愈合质量的机制之一。
参考文献
[1] 杨雪松，李益农，叶嗣懋，等.大鼠胃溃疡愈合质量与抗强的松再损伤关系的实验研究[J].北京医科大学学报，1996，28(6)：275.
[2] 鄢顺琴，凤良元，陈向涛.胃痛灵保护胃黏膜作用及对胃溃疡愈合质量的影响[J].中国中西医结合杂志，1995，15(10)：612.
[3] Tarnawski A，Hollander D，William JK，et al.“Healed” experimental gastric ulcers remain histologically and ultrastructurally abnormal[J].J Clin Gastroenterol，1990，12(Suppl 1)：s139－s147.
[4] 谭永港，张永锋.健胃汤对大鼠实验性胃溃疡治疗作用及其机理研究[J].中国中医药信息杂志，2001，8(8)：29.
【摘要】 目的 探讨健脾化瘀清热代表药(黄芪、丹参、黄连)对胃溃疡愈合质量(QOUH)的影响及作用机制。方法 采用大鼠乙酸胃溃疡模型，观察黄芪、丹参、黄连对该模型QOUH的影响；原位分子杂交法检测表皮生长因子受体(EGFR)mRNA的表达。结果 黄芪、丹参、黄连均能改善胃黏膜组织的损伤，黄芪、丹参能增强溃疡周围组织EGFR mRNA的表达。结论 健脾化瘀清热药提高QOUH、增强溃疡瘢痕处EGFR mRNA的表达可能是健脾化瘀药的作用机制之一。
【关键词】 胃溃疡；健脾化瘀清热药；表皮生长因子；溃疡愈合质量；大鼠
Effect of Invigorating Spleen， Eliminating Stasis， Heat-Clearing Drugs on the Quality of Ulcer Healing and Expression of EGFR mRNA in the Rat Model of Gastric Ulcer
ZHANG Yong-feng， WU Zheng-zhi， JIA Xiu-qin， et a
Clinical Institute of Integrated TCM and Western Medicine， Shenzhen Second People Hospital， Shenzhen 518035， China
Abstract：Objective To investigate the effect and mechanism of invigorating spleen， eliminating stasis， heat-clearing drugs (milk veteh， root of red rooted salvia， Chinese goldthread) on quality of ulcer healing (QOUH). Methods The rat models of chronic gastric ulcer was induced by acetic acid， the effects of QOUH of milk veteh， root of red rooted salvia and Chinese goldthread on the model of gastric Ulcer were observed， the expression of EGFR mRNA of mucosa were measured by in situ hybridization. Results Milk veteh， root of red rooted salvia and Chinese goldthread could improve the injury of gastric mucosa. Milk veteh， root of red rooted salvia increased the expression of EGFR mRNA in the tissue around peptic ulcer (PU). Conclusion Invigorating spleen， eliminating stasis， heat-clearing drugs can improve QOUH， it is one of possible mechanisms that the drugs increased the expression of EGFR mRNA in the tissue around PU.
Key words：gastric ulcer；invigorating spleen， eliminating stasis， heat-clearing drugs；epidermal growth factor；quality of ulcer healing；rat
根据中医理论，综观消化性溃疡(peptic ulcer，PU)缓解期临床治疗的有关方药，基本属于健脾、化瘀、清热范畴。本实验通过观察健脾化瘀清热代表药(黄芪、丹参、黄连)对大鼠胃溃疡愈合质量(quality of ulcer healing，QOUH)及其表皮生长因子受体(EGFR)mRNA表达的影响，为中医药提高PU远期疗效提供思路与方法。
1 实验材料
1.1 实验动物
SD大鼠90只，雌性，体重180～220 g，广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号：0028062。
1.2 药物与试剂
黄芪、丹参、黄连由深圳市第二人民医院第一门诊部中药房提供，各单味药物置于搪瓷药罐中，以1∶10比例加入蒸馏水浸泡2 h，加热煮沸30 min，滤出头煎，药渣加蒸馏水适量，再煮沸30 min，滤出二煎，合并2次滤液，浓缩成200%，置冰箱中保存。西咪替丁片，江西制药有限责任公司生产，批号990808-1。EGFR mRNA试剂盒，购自武汉博士德生物工程有限公司。
1.3 仪器
显微镜测微尺(武汉光学仪器厂生产)，原位杂交专用盖玻片(博士德公司产品)，杂交盒，S-HH-W型恒温水浴箱(上海浦东跃欣科学仪器厂)，SYQ-ZDX-35BⅠ型自动座式压力蒸气灭菌器(上海申安医疗器械厂)，CMIAS真彩色病理图像分析系统(北京航空航天大学)，Nikon P-Ⅲ显微摄影系统(日本)。
2 实验方法
2.1 造模
参考文献
[1]方法。大鼠造模前24 h禁食不禁水。用20%乌拉坦4 mL/kg体重腹腔注射麻醉。腹部备皮、消毒，于剑突下腹中线打开腹腔，手术切口长约2 cm，暴露出胃，在胃前壁浆膜面窦体交界处同一部位(避开血管)用浸有冰醋酸、直径为5 mm的圆形滤纸接触2次，每次30 s，然后还纳胃体，逐层缝合切口，涂上一层稀释的火棉胶，保护切口。 2.2 分组与给药
造模大鼠清醒后，完全随机分为6组：正常对照组、模型对照组、西咪替丁组、黄芪组(健脾药)、丹参组(化瘀药)及黄连组(清热药)，每组15只。于造模第6天开始灌胃，黄芪、丹参及黄连给药剂量均为20 g/(kg?d)，西咪替丁给药剂量为67 mg/(kg?d)，对照组予0.9% NaCl溶液14.6 mL/(kg?d)。每天1次，共16 d。所有药物溶液及0.9%NaCl溶液pH值均为7.0。于造模第22天断头处死大鼠，检测指标及取材。
2.3 标本的采集和处理
大鼠禁食不禁水24 h后断头处死，剖腹取胃，以溃疡瘢痕平行于胃长轴方向的最长径为中心取材，8%甲醛固定，石蜡包埋，以瘢痕的最长径为中心连续切片，间隔5 μm，分别作苏木素-伊红(HE)染色和AB(pH 2.5)/PAS染色；取溃疡瘢痕周围组织一块，4%多聚甲醛(含DEPC)固定、石蜡包埋、切片，原位分子杂交方法观察EGFR mRNA的表达。
2.4 观察指标
2.4.1 再生黏膜厚度、黏膜肌层缺损宽度[2]
治疗16 d后，药物组肉眼见溃疡基本愈合，在HE染色的连续切片上，用低倍镜找到溃疡愈合部位，在高倍镜下观察测量，用显微镜测微尺分别测5个视野长度，计算其平均值。
2.4.2 表面黏液厚度[2]
在HE染色的切片上找到溃疡愈合部位，在对应的AB/PAS染色的切片上观察，用测微尺分别测5个视野的表面黏液厚度，计算其平均值。
2.4.3 表皮生长因子受体mRNA的表达
实验步骤按试剂盒说明书操作，以细胞胞浆着色呈棕黄色为阳性，计算机图像分析采用北京航空航天大学图像分析中心和空军总医院生物医学工程研究所研制的CMIAS真彩色病理图像分析系统进行，在光镜下(×400)每张切片随机选取5个视野，用“体视学分析”模型作图像分析后，计算平均光密度和平均灰度。
2.5 统计学方法
数据以x±s表示，组间差异性比较采用两样本均数比较的t检验。
3 结果
(见表1、表2)表1 治疗后大鼠再生黏膜厚度、黏膜肌层缺损宽度及黏液厚度(略)注：与模型对照组比较，*P&<0.01；与西咪替丁组比较，△P&<0.05(下同)。表2 黄芪、丹参、黄连对大鼠胃黏膜组织EGFR mRNA表达的影响(略)
4 讨论
PU是临床的常见病、多发病，目前药物治疗近期愈合较好，但停药后仍有较高的复发率，因此PU的治疗应着眼于提高远期疗效，防治复发。
Tarnawski等[3]首先提出了QOUH的概念，认为溃疡的愈合不仅需要黏膜缺失的修复，更需要黏膜下组织结构的修复重建。评价溃疡愈合的情况不仅仅是内镜或直视下对浅表再生黏膜的观察，还应了解黏膜下组织重建的情况。评价QOUH不仅要评价溃疡局部再生黏膜结构成熟度，更应重视其功能成熟度，并以此判定其对未来溃疡复发的影响及评价药物对溃疡的疗效。我们在原来研究的基础上[4]，试图从理、法入手，探讨健脾化瘀清热代表药(黄芪、丹参、黄连)对QOUH的影响，实验结果表明：黄芪、丹参、黄连组再生黏膜厚度增加，黏膜肌层缺损宽度减小，与0.9%NaCl溶液组比较，有非常显著性差异(P&<0.01)，说明黄芪、丹参、黄连能提高再生黏膜组织学成熟度，提高黏膜修复能力。黄芪、丹参、黄连组及西咪替丁组表面黏液厚度均高于生理盐水组(P&<0.01)，且黄芪、丹参、黄连组又高于西咪替丁组(P&<0.01)，说明黄芪、丹参、黄连能促进黏液分泌，其作用优于西咪替丁。
在众多生长因子中，与胃肠道上皮生长、修复有关的因子很多，但目前研究最多、最受重视的仍是表皮生长因子(EGF)及其EGFR。EGF是一种具有抑制胃酸分泌、促进上皮增殖、组织修复和细胞保护作用的内源性物质，在保护胃黏膜免受损伤因子破坏、维持胃肠黏膜完整性方面起着非常重要的作用，是近年发现的在细胞增殖和分化中起重要作用的分子；而生长因子要发挥作用，必须与相应的受体结合。EGFR是一种单链跨细胞膜糖蛋白，对EGF有高度的特异性和亲和力，当EGF到达靶细胞表面时，便很快与细胞膜上EGFR结合，从而发挥其生理功能，促进组织修复、溃疡愈合。实验结果表明，黄芪、丹参增强溃疡周围组织EGFR mRNA的表达，可能是其提高溃疡愈合质量的机制之一。
参考文献
[1] 杨雪松，李益农，叶嗣懋，等.大鼠胃溃疡愈合质量与抗强的松再损伤关系的实验研究[J].北京医科大学学报，1996，28(6)：275.
[2] 鄢顺琴，凤良元，陈向涛.胃痛灵保护胃黏膜作用及对胃溃疡愈合质量的影响[J].中国中西医结合杂志，1995，15(10)：612.
[3] Tarnawski A，Hollander D，William JK，et al.“Healed” experimental gastric ulcers remain histologically and ultrastructurally abnormal[J].J Clin Gastroenterol，1990，12(Suppl 1)：s139－s147.
[4] 谭永港，张永锋.健胃汤对大鼠实验性胃溃疡治疗作用及其机理研究[J].中国中医药信息杂志，2001，8(8)：29.