作者：郑攀，封银曼，郑宏，杨新年，夏寒星
【摘要】 目的 观察补肾醒脑方对血管性痴呆(VD)大鼠脑神经细胞凋亡的影响，探讨其病理机制。方法 采用反复夹闭双侧颈总动脉伴低血压造成拟VD大鼠模型，通过原位末端标记(TUNEL)法检测脑神经细胞凋亡情况。结果 补肾醒脑高、低剂量组可抑制缺血再灌注后神经细胞的凋亡。结论 补肾醒脑方能抑制脑神经细胞凋亡，缓解兴奋性毒性损伤，保护大脑神经细胞，这可能是补肾醒脑方治疗VD的作用机制之一。
【关键词】 补肾醒脑方；血管性痴呆；原位末端标记；细胞凋亡；大鼠
Abstract：Objective To study the pathology mechanism of vascular dementia (VD) rats and study the effect of Bushenxingnao (BSXN) prescription on cerebral neurocyte apoptosis. Method Experimental VD model rats were caused by clipping two side of total artery in neck repeatedly and to examine cerebral neurocyte apoptosis with TUNEL. Results Both the high and low dose BSXN abated excitatory toxic infury and inhibit neurocyte apoptosis after ischemia-refusion. Conclusion BSXN prescription can repress cerebral neurocyte apoptosis， to abate its excitatory nerotoxicity， to protect cerebral neurocyte， which may be one of the mechanisms of to treating the lesion.
Key words：Bushenxingnao prescription；vascular dementia；situ nick-end labeling；apoptosis；rat
血管性痴呆(vascular dementia，VD)是一系列脑血管因素导致脑组织损害而产生的痴呆症状的总称，是在智能获得充分发展后，由于中风的损害造成退化的结果。笔者采用具有益气补肾、祛瘀化痰、醒脑开窍作用的补肾醒脑方，观察该药对反复夹闭双侧颈总动脉伴低血压所致痴呆模型大鼠脑神经细胞凋亡的影响，旨在揭示补肾醒脑方治疗VD的脑保护机制。
1 实验材料
1.1 动物
健康成年雄性Wistar大鼠100只，普通级，体重(215±15)g，河南医科大学实验动物中心提供。
1.2 药物及试剂
补肾醒脑方(人参9 g，熟地黄12 g，制首乌12 g，女贞子12 g，赤芍9 g，丹参9 g，川芎9 g，远志6 g，石菖蒲6 g，天麻6 g)，方中药物均一次性购于河南省药材公司，并经河南中医学院中药教研室鉴定为正品。制备：用药物总体积的5倍量水浸泡2 h，煎沸后改文火煎，煎煮1 h后倒出药液；继用药物体积3倍量水，先后再煎2次，合并3次滤液。滤过，滤液用文火分别浓缩至(含原药材)浓度为高剂量(3 g/mL)、低剂量(1.5 g/mL)的浓缩液。无菌条件装瓶，置4 ℃冰箱保存备用。喜得镇，天津华津制药厂与北京诺华制药有限公司合作生产，批号030212，用生理盐水配制成0.03 mg/mL的药液备用。硝普钠粉针剂，50 mg/支，北京双鹤现代医药技术有限公司生产，批号0302162，用5%葡萄糖注射液配制成0.25 mg/mL的药液，黑纸包裹避光保存备用。水合氯醛，上海五联化工厂生产，批号20020418，用生理盐水配制成100 mg/mL的药液备用；亚硝酸钠，天津市四通化工厂生产，批号20020710；无水乙醇，郑州化学试剂二厂生产，批号030812；多聚甲醛，天津市博迪化工有限公司生产，批号2001920；原位末端标记检测凋亡试剂盒(TUNEL)，法国博士德公司产品。
1.3 仪器
轮转式切片机，德国Leitz 2145；BX60研究用万能显微镜，日本OLYMPUS公司。
2 实验方法
2.1 动物分组
动物购入后随机分为5组：模型组(MX组)、假手术组(JS组)、喜德镇组(XD组)及补肾醒脑高(BH组)、补肾醒脑低剂量组(BS)。每组按1、24 h分别再分2组，每组10只，每笼5只喂养。大鼠自由觅食饮水，在室温22～25 ℃、相对湿度40%～50%的环境中喂养3 d，待大鼠适应环境后开始实验。
2.2 给药
JS、MX组：生理盐水ig，1 mL/100 g，1次/d；XD组：喜德镇ig，1 mL/100 g，1次/d(0.6 mg/kg，相当于正常成人用量的20倍)；BH组：补肾醒脑方(3 g/mL)ig，1次/d(30 g/kg，相当于正常成人用量的20倍)；BS组：补肾醒脑方(1.5 g/mL)ig，1次/d(15 g/kg，相当于正常成人用量的10倍)。
2.3 造模
灌胃第7日给药后1 h，将大鼠用10%水合氯醛(350 mg/kg，腹腔注射)麻醉后仰卧固定在手术台上，常规消毒，颈正中切口，分离双侧颈总动脉，穿线备用。同时腹腔注射硝普钠(3.5 mg/kg)造成低血压，随即用无创动脉夹关闭双侧颈总动脉10 min后，再通10 min，反复3次，再通后缝合伤口，放回笼中保温饲养。次日继续灌胃，给药3 h后，大鼠断头处死取脑。假手术组只分离颈总动脉，腹腔注射硝普钠，不进行缺血再灌注手术。
2.4 脑神经细胞凋亡检测
2.4.1 取材方法
分别于造模后1、24 h断头处死大鼠，在冰盘上迅速剥离取脑，切取左侧大脑组织，立即放入4%多聚甲醛溶液中，固定24 h后取出，改刀成1 mm3的组织块，室温下70%、80%、95%、100%乙醇梯度脱水，二甲苯透明2次，用54 ℃低熔点石蜡浸蜡2次，石蜡包埋。5 μm常规切片，苏木素-伊红(HE)染色，供原位末端标记(TUNEL)检测法使用。
2.4.2 脑神经细胞TUNEL检测细胞凋亡方法
石蜡切片厚度5 μm，裱于用多聚赖氨酸处理过的载玻片上，置入45 ℃温箱烤片24 h；切片常规脱蜡至无水；磷酸缓冲液(PBS)0.01 mol/L pH 7.4，冲洗2次，5 min/次；滴加蛋白酶K，消化5 min，PBS冲洗2次，5 min/次；吸干切片周围水分，滴加0.3%过氧化氢溶液，室温15 min，以封闭内源性过氧化物酶活性，PBS冲洗2次，5 min/次；吸干切片周围水分，滴加末端标记酶，置湿盒内37 ℃水浴1 h，PBS冲洗3次，5 min/次；滴加抗荧光素抗体，置湿盒内37 ℃水浴1 h，PBS冲洗3次，5 min/次；二氨基联苯胺(DAB)显色10 min，蒸馏水洗；苏木素复染10 min，蒸馏水洗；常规脱水，透明，树脂胶封片，光学显微镜下观察。
2.4.3 观察方法
每张切片分别选取互不重叠的6个(20×10)视野，计数TUNEL染色阳性细胞数进行分析，显微镜下胞浆或胞核有深棕色颗粒者为阳性细胞，染色越深，阳性细胞数越多即阳性表达越强。
2.5 统计学方法
数据用x±s表示，组间比较采用方差分析、t检验。
3 结果
(见表1)表1 补肾醒脑方对实验性VD大鼠脑神经细胞凋亡的影响
(略)注：与JS组比较，*P&<0.05，**P&<0.001；与MX-24组比较，※P&<0.05，※※P&<0.01；与XD-24 h组比较，▽P&<0.05。
4 讨论
目前认为，一次或多次脑梗死造成的脑组织损害导致脑功能不全，是VD发生的重要原因。由于脑组织反复缺血，导致海马、基底神经结及皮层等结构产生不可逆性损伤，随之出现痴呆症状。神经元供血障碍可导致该细胞的缺血性损伤，脑细胞不仅仅发生被动死亡坏死，而且也以凋亡的方式主动选择死亡。其特点是急性期神经元的死亡是以坏死为主，而继发性死亡或迟发性死亡则以凋亡为主[1-2]。坏死性神经元死亡绝大多数位于缺血中心区，而凋亡性神经元死亡则主要分布于缺血半暗带区，缺血半暗带区具有迟发性，一般认为半暗带自缺血后很快出现，通常会持续24 h[3]。
TUTEL法在细胞凋亡的研究中已被广泛采用，细胞凋亡发生时，钙离子内流，内源性核酸内切酶活化，将DNA链裂解成180～200个碱基为基数的许多个核小体片段，同时暴露出大量的3’-OH断端，TdT可特异性结合带3’-OH的核苷酸片段，并形成Dupp-biotin组成的脱氧核苷酸多聚体，后经带有过氧化物酶的抗biotin抗体标记，经染色，阳性者提示凋亡细胞存在[4]。由于在正常的或在增殖的细胞中几乎没有DNA断裂，因而没有3’-OH端形成，很少能够被染色。TUTEL法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能够准确地反映细胞凋亡的最典型的生物化学和形态学特征，并可检测出极少量的凋亡细胞[5]。
关于脑缺血再灌注后神经细胞何时开始发生凋亡，目前尚无一致结论，但多数研究证实它出现较早且持续存在[6]。再灌注24 h，凋亡细胞最多。本课题采用TUNEL方法观察到，反复脑缺血30 min再灌注1 h，即可见少量凋亡细胞；反复脑缺血30 min再灌注24 h，可见大量凋亡细胞。本结果显示，补肾醒脑方对拟VD模型所致细胞凋亡有明显的抑制作用，能够降低继发性神经细胞的损伤程度，保护缺血后神经元细胞及防止神经元细胞的丢失。
【参考文献】
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[5] 李小玲.脑缺血细胞凋亡的分子生物学机制[J].国外医学?脑血管疾病分册，2002，8(4)：7－9.
[6] 王守春，张 昱，常 明，等.慢性脑缺血痴呆大鼠神经细胞凋亡的研究[J].中国临床康复，2003，7(25)：3412－3413.