作者：王建明，马骁，周童亮，李桂琴，黄小杰，王平，阎小萍
【摘要】 目的 探讨补肾强督方治疗强直性脊柱炎(AS)的可能作用机制。方法 30例AS患者予补肾强督方进行治疗，疗程为6个月。研究AS患者及健康志愿者外周血中白细胞介素18（IL-18)、干扰素γ（IFN-γ）、白细胞介素4 mRNA(IL-4 mRNA)表达水平及经补肾强督方治疗前后AS患者外周血中IL-18、IFN-γ、IL-4 mRNA表达水平的变化。结果 AS患者外周血单个核细胞IL-18 mRNA、IFN-γmRNA表达水平及IFN-γmRNA/IL-4 mRNA较正常对照组显著增高(P&<0.001)。经用补肾强督方治疗后，IL-18 mRNA、IFN-γ mRNA表达水平及IFN-γmRNA/IL-4 mRNA明显下降(P&<0.001)。AS患者红细胞沉降率水平与IL-18 mRNA、IFN-γ mRNA、IL-4 mRNA表达水平呈极显著相关(P&<0.001)；C反应蛋白水平与IL-18 mRNA表达水平呈显著相关(P&<0.05)，与IFN-γmRNA表达水平呈非常显著相关(P&<0.01)。
结论 AS患者外周血中IL-18 mRNA、IFN-γmRNA水平比正常组明显升高；用补肾强督方治疗后，患者IL-18 mRNA、IFN-γmRNA水平均有明显下降。
【关键词】 补肾强督方；强直性脊柱炎；IL-18 mRNA；IFN-γmRNA；IL-4 mRNA
Abstract：Objective To study the possible mechanism of Bushenqiangdu recipe in treatment of ankylosing spondylitis (AS). Methods 30 out-patients were treated by Bushenqiangdu recipe for 6 months. The expression level of IL-18， IFN-γ， IL-4 mRNA in outer-circumference blood of as patients and healthy volunteers were studied， as well as the change expression level of IL-18， IFN-γ， IL-4 mRNA of as patients outer-circumference blood before and after treatment. Result The expression level of IL-18， IFN-γmRNA in AS patients PBMC group is higher prominently than control PBMC group (P&<0.001). After treated by Bushenqiangdu recipe， the expression level of IL-18， IFN-γmRNA declines prominently (P&<0.001). ESR expression level is very prominently correlative with expression level of IL-18， IFN-γ， IL-4 mRNA in AS patients (P&<0.001). CRP is prominently correlative with expression level of IL-18 mRNA in AS patients (P&<0.05). CRP is very prominently correlative with expression level of IFN-γmRNA in AS patients (P&<0.01). Conclusion The expression level of IL-18， IFN-γmRNA in outer-circumference blood of AS patients is higher prominently than healthy volunteers. After treatment by Bushenqiangdu recipe， the expression level of IL-18， IFN-γmRNA declines prominently.
Key words：Bushenqiangdu recipe；ankylosing spondylitis；IL-18 mRNA；IFN-γmRNA；IL-4 mRNA
白细胞介素(interleukin，IL)18，原名干扰素γ(IFN-γ)诱导因子，可诱导Th1反应，在各种过敏性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病及感染性疾病中起免疫调节作用[1]。但强直性脊柱炎(AS)患者有无IL-18的表达，IL-18促Th1反应及促炎性损伤方面的作用是否与AS的病理过程有关，是否参与了AS患者的Th1/Th3细胞因子平衡的调节，均有待明确。本实验以β-actin为内参照，以IL-4、IFN-γ分别作为Th1、Th3细胞因子的指标，用半定量反转录多聚酶链反应(RT-PCR)法测定AS患者、正常对照组及经补肾强督方治疗后患者外周血单个核细胞(PBMC)中IL-18、IL-4、IFN-γmRNA水平，观察IL-18与IL-4、IFN-γ及疾病活动指标红细胞沉降率(ESR)和C反应蛋白(CRP)的相关性，试图从细胞因子及其平衡调节这一角度了解AS的发病机制，为AS的诊断与治疗提供新的思路。
补肾强督方是阎小萍教授在长期临床实践的基础上总结出来的，经临床验证，对AS患者具有明显治疗效果。它针对AS“肾虚督寒、风寒湿深侵肾督”的主要病机，在治疗上以补肾强督为治疗大法，同时辅以化湿疏风、养肝荣筋、化瘀通络。本实验从分子生物学角度进一步深入探讨补肾强督方治疗AS的可能作用机制。
1 资料与方法
1.1 病例选择
30例AS患者均为2002年10月－2004年10月中日友好医院中医风湿病科门诊和住院患者，均符合美国风湿病学会1984年修定的纽约标准[2]。其中男性21例，女性9例；年龄最小18岁，最大45岁，平均(25.47±7.53)岁；病程最短3个月，最长18年，平均病程(5.64±4.26)年。对照组为20名健康志愿者，其中男性12例，女性8例，平均年龄(26.56±6.54)岁。
1.2 治疗方案
所选病例均予补肾强督方进行治疗，每日1剂，水煎取汁，分2次服。疗程为6个月。
1.3 试剂和仪器
M-MLV反转录酶(Promega)、RNA酶抑制剂(Rnasin)、dNTP、Taq酶(BBI)、Trizol(Gibco)、DEPC、随机引物A[oligo d(T)18]、随机引物B、琼脂糖(Promega)；Gene Amp 2400型PCR仪、UV1200型紫外可见光分光光度计(日本岛津)。
1.4 分离纯化
按常规方法以淋巴细胞分离液分离静脉血PBMC。
1.5 总RNA提取
总RNA提取采用Trizol抽提法，严格按Gibco公司使用说明书操作。
1.6 RT反应合成cDNA(反应体系20 μL)
①将8 μL RNA、1 μL引物A、1 μL引物B加入0.5 mL ep管中，离心混匀数秒，70 ℃变性5 min，冰浴冷却。②加入M-MLV 1 μL，dNTP 2 μL，5×buffer 4 μL，rNasin 1 μL，DEPC水2 μL，离心数秒混匀，于42 ℃水浴箱中反应60 min，95 ℃ 5 min。
1.7 PCR扩增
1.7.1 引物设计及合成
参考有关文献设计引物序列，由上海申能博彩生物科技有限公司合成，并检索Genbank基因库检查序列的正确性。IL-18：正意义链5'-GCTTGAATCTAAA TTATCAGTC-3'，反意义链5'-GAAGATTCAAATTGCTCTTAT-3'[3]，扩增产物长度为342 bp。IFN-γ：正意义链5'-GCAGAGCCAAATTGT CTCCT-3'，反意义链5’-ATGCTCTTCGACCTCGAAAC-3'，扩增产物长度为290 bp。IL-4：正意义链5'-CTGCAAATCGACACCTATTA-3'，反意义链5'-GATCGTCTTTAGCCTTTC-3'，扩增产物长度为449 bp。β-actin：正意义链5'-CGGGAAATCGTGCGTGACAT-3’，反意义链5'-GAACTTTGGGGGATGCTCGC-3'[4]，扩增产物长度为712 bp。
1.7.2 PCR扩增
摸索共扩增、循环数、温度及模板浓度等因素对扩增的影响，对反应体系进行优化，并确定样本中最高模板浓度在该条件下仍未达到饱和状态。优化后的反应体系(50 μL)及反应条件与循环数如下。IL-18：10×PCR buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl2 3 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，IL-18上、下游引物各1 μL，β-actin上、下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，Taq酶(0.5 U/μL)0.5 μL，用DEPC水补充至总反应体积为50 μL；94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共反应32个循环。IFN-γ：10×PCR buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl2 3 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，IFN-γ上、下游引物各1 μL，β-actin上、下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，DEPC水补充至总反应体积为49.5 μL，先94 ℃预变性3 min，然后加Taq酶(0.5 U/μL)0.5 μL；94 ℃变性40 s，52 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，共反应35个循环，然后72 ℃再延伸10 min。IL-4：10×PCR buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl2 3 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，IL-4上、下游引物各1 μL，β-actin上、下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，用DEPC水补充至总反应体积为49.5 μL，先94 ℃预变性3 min，然后加Taq酶(0.5 U/μL)0.5 μL；94 ℃变性40 s，50 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，共反应35个循环，然后72 ℃再延伸10 min。
1.8 PCR产物的电泳分析
cDNA样品8 μL与上样缓冲液2 μL混合后，缓慢加至样品槽中，此时应使凝胶浸没在缓冲液中。盖上电泳槽并通电，使cDNA向阳极(红线)移动，100 V约1 h。紫外灯下观察、拍照。照片扫描后用ScnImage图像分析软件计算IL-18、IL-4、IFN-γ的PCR产物与看家基因β-actin的比值，得到各自的相对量。
1.9 统计学方法
实验数据用x±s表示，组间、治疗前后显著性检验采用t检验，非参相关检验采用Spearman相关分析方法。
2 结果
2.1 AS患者PBMC与正常对照组PBMC外周血IL-18 mRNA、IFN-γmRNA、IL-4 mRNA的表达
AS患者PBMC中IL-18 mRNA、IFN-γmRNA表达水平较正常对照PBMC显著增高，差异有极显著性(P&<0.001)；IL-4 mRNA表达水平无明显差异(P&>0.05)；AS患者PBMC IFN-γmRNA/IL-4 mRNA比值比正常对照PBMC显著增高，差异有极显著性(P&<0.001)，见表1。 表1 AS患者PBMC与正常对照PBMC外周血IL-18 mRNA、IFN-γmRNA、IL-4 mRNA的表达(略)注：与正常对照组比较，***P&<0.001。
2.2 补肾强督方对AS患者PBMC IL-18 mRNA、IFN-γ mRNA、IL-4 mRNA表达水平的影响
经用补肾强督方治疗后，IL-18 mRNA、IFN-γmRNA表达水平及IFN-γmRNA/IL-4 mRNA比值明显下降，差异有极显著性(P&<0.001)；IL-4 mRNA表达水平无明显改变(P&>0.05)，见表2。表2 补肾强督方对AS患者治疗前后PBMC IL-18 mRNA、IFN-γmRNA、IL-4 mRNA表达水平的影响（略）注：与治疗前比较，***P&<0.001。
2.3 AS患者外周血中Th1细胞、Th3细胞、IL-18 mRNA、IFN-γ mRNA、IL-4 mRNA表达水平与炎症活动指标相关性分析
AS患者ESR水平与IL-18 mRNA、IFN-γmRNA、IL-4 mRNA表达水平呈极显著相关(P&<0.001)；CRP水平与IL-18 mRNA表达水平呈显著相关(P&<0.05)；与IFN-γmRNA表达水平呈非常显著相关(P&<0.01)；与IL-4 mRNA表达水平无显著相关(P&>0.05)，见表3。 表3 AS患者PBMC IL-18 mRNA、IFN-γmRNA、IL-4 mRNA 表达水平与炎症活动指标相关性分析（略）
3 讨论
外周成熟的T细胞按表型不同可分为CD4+T细胞和CD8+T细胞。根据CD4+Th细胞所分泌的细胞因子不同，将其分为Th0、Th1和Th3三种亚型。抗原刺激后短期内T细胞可产生多种细胞因子，即Th0细胞，随后受细胞因子、抗原特性、激素等因素的影响，使Th0向Th1或Th3分化。Th1细胞偏向于分泌IL-2、IFN-γ，与TDTH细胞和Tc细胞的增殖、分化、成熟有关，因此Th1细胞可促进细胞介导的免疫应答。Th3细胞偏向于分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10，它与B细胞增殖、成熟和促进抗体生成有关，故可增强抗体介导的免疫应答。Th1型细胞因子和Th3型细胞因子之间存在错综复杂的关系，如IL-4可促进Th3细胞增生，IL-4、IL-10等分泌增多，同时抑制Th1细胞的活性。IL-12则可激活Th1细胞，对Th3细胞分泌细胞因子有抑制作用。与此同时，Th1、Th3细胞与NK细胞、CTL细胞、巨噬细胞等其他细胞一起，形成了一个调节网络，维持着Th1和Th3细胞的平衡。
IL-18是一种新的细胞因子，来源于单核-巨噬细胞，作为IFN-γ产生诱导因子而被发现，在结构上与IL-1相似，在功能上与IL-12相似。IL-18的功能有许多与IL-12相似的部分，其主要表现为对NK细胞和T细胞的作用。在T细胞中主要是作用于Th1细胞，从而引起其活化。IL-18能显著诱导IFN-γ的产生，IL-18对于CD4+T细胞具有促增殖作用，作用于Th1细胞，促进分泌Th1相关的细胞因子。根据鼠无性繁殖的详细分析，对于Th1的无性繁殖，IL-18可诱导Th1细胞增殖，IFN-γ及IL-2的产生，并可发现Th1细胞的IL-2受体α链；而对于Th3无性繁殖，并不诱导细胞增殖也不产生IL-4。对于纯化的T细胞，IL-18可诱导Th1型细胞因子(IFN-γ、IL-2)的产生，而不诱导Th3细胞因子的产生。IL-18能增强Th1细胞上功能性FasL的表达，选择性地增强FasL介导的Th1细胞的细胞毒作用[5]。
本研究发现：AS患者外周血中IL-18 mRNA、IFN-γmRNA水平比正常组明显升高。经用补肾强督方治疗后，患者IL-18 mRNA、IFN-γmRNA水平均有明显下降。由此可以推测，在AS患者体内，IL-18产生增多，一方面诱导Th1细胞增殖，另一方面诱导Th1型细胞因子IFN-γ的产生增多，导致Th1/Th3的平衡、细胞因子的网络平衡受到破坏，致炎因子不断增加，而保护因子不断降低，出现“免疫偏斜”，从而导致AS的发病。补肾强督方能显著下调AS患者增多的致炎因子，纠正患者体内的“免疫偏斜”，从而在临床上往往取得好的治疗效果。
【参考文献】
[1] Ushio S， Namba M， Okura T， et al. Cloning of the cDNA for human IFN-γ inducing factor， expression in Escherichia coli， and studies on the biological activities of the protein[J].J Immunol，1996， 156：4274.
[2] 张乃峥.临床风湿病学[M].上海：上海科学技术出版社，1999.165.
[3] 刘华锋，陈孝文，许勇芝，等.原发性肾小球肾炎患者外周血IL-18mRNA表达的研究[J].免疫学杂志，2001，17(5)：373.
[4] 李忆农，施桂英.白细胞介素-18在类风湿关节炎外周血单个核细胞中的表达[J].中华风湿病学杂志，2001，5(2)：95.
[5] Kohno K， Kataoka J. IFN-γ inducing factor (IGIF) is a costimulatory factor on the activation of Th1 but not Th3 cells and exerts its effect independently of IL-12[J].J Immunology，1997，158：1541.
【摘要】 目的 探讨补肾强督方治疗强直性脊柱炎(AS)的可能作用机制。方法 30例AS患者予补肾强督方进行治疗，疗程为6个月。研究AS患者及健康志愿者外周血中白细胞介素18（IL-18)、干扰素γ（IFN-γ）、白细胞介素4 mRNA(IL-4 mRNA)表达水平及经补肾强督方治疗前后AS患者外周血中IL-18、IFN-γ、IL-4 mRNA表达水平的变化。结果 AS患者外周血单个核细胞IL-18 mRNA、IFN-γmRNA表达水平及IFN-γmRNA/IL-4 mRNA较正常对照组显著增高(P&<0.001)。经用补肾强督方治疗后，IL-18 mRNA、IFN-γ mRNA表达水平及IFN-γmRNA/IL-4 mRNA明显下降(P&<0.001)。AS患者红细胞沉降率水平与IL-18 mRNA、IFN-γ mRNA、IL-4 mRNA表达水平呈极显著相关(P&<0.001)；C反应蛋白水平与IL-18 mRNA表达水平呈显著相关(P&<0.05)，与IFN-γmRNA表达水平呈非常显著相关(P&<0.01)。
结论 AS患者外周血中IL-18 mRNA、IFN-γmRNA水平比正常组明显升高；用补肾强督方治疗后，患者IL-18 mRNA、IFN-γmRNA水平均有明显下降。
【关键词】 补肾强督方；强直性脊柱炎；IL-18 mRNA；IFN-γmRNA；IL-4 mRNA
Effect of Bushenqiangdu Recipe on the Expression Level of IL-18， IFN-γ， IL-4 mRNA of Ankylosing Spondylitis
WANG Jian-ming， MA Xiao， ZHOU Tong-liang， et al
1.Department of TCM Rheumatology， China-Japan Friendship Hospital， Beijing 100029， China；2.Clinical Medicine Institute， China-Japan Friendship Hospital， Beijing 100029， China
Abstract：Objective To study the possible mechanism of Bushenqiangdu recipe in treatment of ankylosing spondylitis (AS). Methods 30 out-patients were treated by Bushenqiangdu recipe for 6 months. The expression level of IL-18， IFN-γ， IL-4 mRNA in outer-circumference blood of as patients and healthy volunteers were studied， as well as the change expression level of IL-18， IFN-γ， IL-4 mRNA of as patients outer-circumference blood before and after treatment. Result The expression level of IL-18， IFN-γmRNA in AS patients PBMC group is higher prominently than control PBMC group (P&<0.001). After treated by Bushenqiangdu recipe， the expression level of IL-18， IFN-γmRNA declines prominently (P&<0.001). ESR expression level is very prominently correlative with expression level of IL-18， IFN-γ， IL-4 mRNA in AS patients (P&<0.001). CRP is prominently correlative with expression level of IL-18 mRNA in AS patients (P&<0.05). CRP is very prominently correlative with expression level of IFN-γmRNA in AS patients (P&<0.01). Conclusion The expression level of IL-18， IFN-γmRNA in outer-circumference blood of AS patients is higher prominently than healthy volunteers. After treatment by Bushenqiangdu recipe， the expression level of IL-18， IFN-γmRNA declines prominently.
Key words：Bushenqiangdu recipe；ankylosing spondylitis；IL-18 mRNA；IFN-γmRNA；IL-4 mRNA
白细胞介素(interleukin，IL)18，原名干扰素γ(IFN-γ)诱导因子，可诱导Th1反应，在各种过敏性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病及感染性疾病中起免疫调节作用[1]。但强直性脊柱炎(AS)患者有无IL-18的表达，IL-18促Th1反应及促炎性损伤方面的作用是否与AS的病理过程有关，是否参与了AS患者的Th1/Th3细胞因子平衡的调节，均有待明确。本实验以β-actin为内参照，以IL-4、IFN-γ分别作为Th1、Th3细胞因子的指标，用半定量反转录多聚酶链反应(RT-PCR)法测定AS患者、正常对照组及经补肾强督方治疗后患者外周血单个核细胞(PBMC)中IL-18、IL-4、IFN-γmRNA水平，观察IL-18与IL-4、IFN-γ及疾病活动指标红细胞沉降率(ESR)和C反应蛋白(CRP)的相关性，试图从细胞因子及其平衡调节这一角度了解AS的发病机制，为AS的诊断与治疗提供新的思路。
补肾强督方是阎小萍教授在长期临床实践的基础上总结出来的，经临床验证，对AS患者具有明显治疗效果。它针对AS“肾虚督寒、风寒湿深侵肾督”的主要病机，在治疗上以补肾强督为治疗大法，同时辅以化湿疏风、养肝荣筋、化瘀通络。本实验从分子生物学角度进一步深入探讨补肾强督方治疗AS的可能作用机制。
1 资料与方法
1.1 病例选择
30例AS患者均为2002年10月－2004年10月中日友好医院中医风湿病科门诊和住院患者，均符合美国风湿病学会1984年修定的纽约标准[2]。其中男性21例，女性9例；年龄最小18岁，最大45岁，平均(25.47±7.53)岁；病程最短3个月，最长18年，平均病程(5.64±4.26)年。对照组为20名健康志愿者，其中男性12例，女性8例，平均年龄(26.56±6.54)岁。
1.2 治疗方案
所选病例均予补肾强督方进行治疗，每日1剂，水煎取汁，分2次服。疗程为6个月。
1.3 试剂和仪器
M-MLV反转录酶(Promega)、RNA酶抑制剂(Rnasin)、dNTP、Taq酶(BBI)、Trizol(Gibco)、DEPC、随机引物A[oligo d(T)18]、随机引物B、琼脂糖(Promega)；Gene Amp 2400型PCR仪、UV1200型紫外可见光分光光度计(日本岛津)。
1.4 分离纯化
按常规方法以淋巴细胞分离液分离静脉血PBMC。
1.5 总RNA提取
总RNA提取采用Trizol抽提法，严格按Gibco公司使用说明书操作。
1.6 RT反应合成cDNA(反应体系20 μL)
①将8 μL RNA、1 μL引物A、1 μL引物B加入0.5 mL ep管中，离心混匀数秒，70 ℃变性5 min，冰浴冷却。②加入M-MLV 1 μL，dNTP 2 μL，5×buffer 4 μL，rNasin 1 μL，DEPC水2 μL，离心数秒混匀，于42 ℃水浴箱中反应60 min，95 ℃ 5 min。
1.7 PCR扩增
1.7.1 引物设计及合成
参考有关文献设计引物序列，由上海申能博彩生物科技有限公司合成，并检索Genbank基因库检查序列的正确性。IL-18：正意义链5'-GCTTGAATCTAAA TTATCAGTC-3'，反意义链5'-GAAGATTCAAATTGCTCTTAT-3'[3]，扩增产物长度为342 bp。IFN-γ：正意义链5'-GCAGAGCCAAATTGT CTCCT-3'，反意义链5’-ATGCTCTTCGACCTCGAAAC-3'，扩增产物长度为290 bp。IL-4：正意义链5'-CTGCAAATCGACACCTATTA-3'，反意义链5'-GATCGTCTTTAGCCTTTC-3'，扩增产物长度为449 bp。β-actin：正意义链5'-CGGGAAATCGTGCGTGACAT-3’，反意义链5'-GAACTTTGGGGGATGCTCGC-3'[4]，扩增产物长度为712 bp。
1.7.2 PCR扩增
摸索共扩增、循环数、温度及模板浓度等因素对扩增的影响，对反应体系进行优化，并确定样本中最高模板浓度在该条件下仍未达到饱和状态。优化后的反应体系(50 μL)及反应条件与循环数如下。IL-18：10×PCR buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl2 3 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，IL-18上、下游引物各1 μL，β-actin上、下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，Taq酶(0.5 U/μL)0.5 μL，用DEPC水补充至总反应体积为50 μL；94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共反应32个循环。IFN-γ：10×PCR buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl2 3 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，IFN-γ上、下游引物各1 μL，β-actin上、下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，DEPC水补充至总反应体积为49.5 μL，先94 ℃预变性3 min，然后加Taq酶(0.5 U/μL)0.5 μL；94 ℃变性40 s，52 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，共反应35个循环，然后72 ℃再延伸10 min。IL-4：10×PCR buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl2 3 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，IL-4上、下游引物各1 μL，β-actin上、下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，用DEPC水补充至总反应体积为49.5 μL，先94 ℃预变性3 min，然后加Taq酶(0.5 U/μL)0.5 μL；94 ℃变性40 s，50 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，共反应35个循环，然后72 ℃再延伸10 min。
1.8 PCR产物的电泳分析
cDNA样品8 μL与上样缓冲液2 μL混合后，缓慢加至样品槽中，此时应使凝胶浸没在缓冲液中。盖上电泳槽并通电，使cDNA向阳极(红线)移动，100 V约1 h。紫外灯下观察、拍照。照片扫描后用ScnImage图像分析软件计算IL-18、IL-4、IFN-γ的PCR产物与看家基因β-actin的比值，得到各自的相对量。
1.9 统计学方法
实验数据用x±s表示，组间、治疗前后显著性检验采用t检验，非参相关检验采用Spearman相关分析方法。
2 结果
2.1 AS患者PBMC与正常对照组PBMC外周血IL-18 mRNA、IFN-γmRNA、IL-4 mRNA的表达
AS患者PBMC中IL-18 mRNA、IFN-γmRNA表达水平较正常对照PBMC显著增高，差异有极显著性(P&<0.001)；IL-4 mRNA表达水平无明显差异(P&>0.05)；AS患者PBMC IFN-γmRNA/IL-4 mRNA比值比正常对照PBMC显著增高，差异有极显著性(P&<0.001)，见表1。 表1 AS患者PBMC与正常对照PBMC外周血IL-18 mRNA、IFN-γmRNA、IL-4 mRNA的表达(略)注：与正常对照组比较，***P&<0.001。
2.2 补肾强督方对AS患者PBMC IL-18 mRNA、IFN-γ mRNA、IL-4 mRNA表达水平的影响
经用补肾强督方治疗后，IL-18 mRNA、IFN-γmRNA表达水平及IFN-γmRNA/IL-4 mRNA比值明显下降，差异有极显著性(P&<0.001)；IL-4 mRNA表达水平无明显改变(P&>0.05)，见表2。表2 补肾强督方对AS患者治疗前后PBMC IL-18 mRNA、IFN-γmRNA、IL-4 mRNA表达水平的影响（略）注：与治疗前比较，***P&<0.001。
2.3 AS患者外周血中Th1细胞、Th3细胞、IL-18 mRNA、IFN-γ mRNA、IL-4 mRNA表达水平与炎症活动指标相关性分析
AS患者ESR水平与IL-18 mRNA、IFN-γmRNA、IL-4 mRNA表达水平呈极显著相关(P&<0.001)；CRP水平与IL-18 mRNA表达水平呈显著相关(P&<0.05)；与IFN-γmRNA表达水平呈非常显著相关(P&<0.01)；与IL-4 mRNA表达水平无显著相关(P&>0.05)，见表3。 表3 AS患者PBMC IL-18 mRNA、IFN-γmRNA、IL-4 mRNA 表达水平与炎症活动指标相关性分析（略）
3 讨论
外周成熟的T细胞按表型不同可分为CD4+T细胞和CD8+T细胞。根据CD4+Th细胞所分泌的细胞因子不同，将其分为Th0、Th1和Th3三种亚型。抗原刺激后短期内T细胞可产生多种细胞因子，即Th0细胞，随后受细胞因子、抗原特性、激素等因素的影响，使Th0向Th1或Th3分化。Th1细胞偏向于分泌IL-2、IFN-γ，与TDTH细胞和Tc细胞的增殖、分化、成熟有关，因此Th1细胞可促进细胞介导的免疫应答。Th3细胞偏向于分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10，它与B细胞增殖、成熟和促进抗体生成有关，故可增强抗体介导的免疫应答。Th1型细胞因子和Th3型细胞因子之间存在错综复杂的关系，如IL-4可促进Th3细胞增生，IL-4、IL-10等分泌增多，同时抑制Th1细胞的活性。IL-12则可激活Th1细胞，对Th3细胞分泌细胞因子有抑制作用。与此同时，Th1、Th3细胞与NK细胞、CTL细胞、巨噬细胞等其他细胞一起，形成了一个调节网络，维持着Th1和Th3细胞的平衡。
IL-18是一种新的细胞因子，来源于单核-巨噬细胞，作为IFN-γ产生诱导因子而被发现，在结构上与IL-1相似，在功能上与IL-12相似。IL-18的功能有许多与IL-12相似的部分，其主要表现为对NK细胞和T细胞的作用。在T细胞中主要是作用于Th1细胞，从而引起其活化。IL-18能显著诱导IFN-γ的产生，IL-18对于CD4+T细胞具有促增殖作用，作用于Th1细胞，促进分泌Th1相关的细胞因子。根据鼠无性繁殖的详细分析，对于Th1的无性繁殖，IL-18可诱导Th1细胞增殖，IFN-γ及IL-2的产生，并可发现Th1细胞的IL-2受体α链；而对于Th3无性繁殖，并不诱导细胞增殖也不产生IL-4。对于纯化的T细胞，IL-18可诱导Th1型细胞因子(IFN-γ、IL-2)的产生，而不诱导Th3细胞因子的产生。IL-18能增强Th1细胞上功能性FasL的表达，选择性地增强FasL介导的Th1细胞的细胞毒作用[5]。
本研究发现：AS患者外周血中IL-18 mRNA、IFN-γmRNA水平比正常组明显升高。经用补肾强督方治疗后，患者IL-18 mRNA、IFN-γmRNA水平均有明显下降。由此可以推测，在AS患者体内，IL-18产生增多，一方面诱导Th1细胞增殖，另一方面诱导Th1型细胞因子IFN-γ的产生增多，导致Th1/Th3的平衡、细胞因子的网络平衡受到破坏，致炎因子不断增加，而保护因子不断降低，出现“免疫偏斜”，从而导致AS的发病。补肾强督方能显著下调AS患者增多的致炎因子，纠正患者体内的“免疫偏斜”，从而在临床上往往取得好的治疗效果。
参考文献
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[4] 李忆农，施桂英.白细胞介素-18在类风湿关节炎外周血单个核细胞中的表达[J].中华风湿病学杂志，2001，5(2)：95.
[5] Kohno K， Kataoka J. IFN-γ inducing factor (IGIF) is a costimulatory factor on the activation of Th1 but not Th3 cells and exerts its effect independently of IL-12[J].J Immunology，1997，158：1541.