作者：张燕明，李晓明，陈信义，徐力
【摘要】 目的 观察三七虫草混合粉抗移植性小鼠乳腺肿瘤(EMT6)及其新生血管形成效应。方法 应用小鼠可移植性EMT6细胞株，经培养传代后，以纯系BALB/C小鼠为荷瘤动物进行移植，并以三七虫草混合粉进行干预，在观察肿瘤抑制率基础上，将肿瘤组织以常规石腊包埋、切片，应用免疫组化法观察肿瘤组织微血管密度(MVD)、血管内皮生长因子(VEGF)、金属蛋白酶组织抑制因子Ⅱ(TIMP-2)表达。结果 所设计两个实验剂量组的肿瘤抑制率分别为48.95%、37.64％；实验两组肿瘤组织MVD、VEGF阳性表达明显降低，TIMP-2表达水平明显增加。结论 三七虫草混合粉能够抑制小鼠乳腺肿瘤生长，抑制肿瘤新生血管形成可能是其作用机制之一。
【关键词】 三七虫草混合粉；乳腺肿瘤；肿瘤组织微血管密度；血管内皮生长因子；金属蛋白酶组织抑制因子Ⅱ
Abstract：Objective To observe inhibition rate of mouse mammary adenocarcinoma (EMT6) and inhibition effect on tumor angiogenesis of Panax notoginseng F.H. Chen and Cordyecps sinensis Sacc. powder. Methods BALB/C mice as bearing cancer animals with subcultured mouse-transplantable EMT6 cell train had accepted intervention treatment by Panax notoginseng F.H. Chen and Cordyceps sinensis Sacc. powder. In this way， inhibition rate of the mouse-transplanted EMT6 by the powder was recorded and the expression of microvessel density (MVD)， vascular endothelial growth factor (VEGF) and tissue inhibitor of metalloproteinase-2 (TIMP-2) in the tumor tissue after paraffin imbedding and section were detected through immunohistochemistry technique. Results The tumor inhibition rates of two designed dose groups were separately 48.95% and 37.64%. MVD and VEGF expressions of tumor tissue in the two group were significantly suppressed while the TIMP-2 expression increased. Conclusions Panax notoginseng F.H.Chen and Cordyceps sinensis Sacc. powder can restrain the growth of EMT6， and the pathway of this function is likely related to inhibiting tumor angiogenesis.
Key words：Panax notoginseng F.H.Chen and Cordyceps sinensis Sacc. powder；mouse mammary adenocarcinoma (EMT6)；MVD；VEGF；TIMP-2
近年来，以三七中主要活性成分“三七总皂苷”制备的“血塞通”、“血栓通”已在心脑血管疾病的治疗中得到了广泛应用，并显示了较为理想的临床疗效。以冬虫夏草制备的药物“百令胶囊”、“金水宝胶囊”、“至灵胶囊”也已应用于临床，并在免疫性疾病、多种慢性病中发挥着治疗效应。依据上述两味中药主治功能，结合现代研究进展，推测三七虫草混合粉对恶性肿瘤有一定的治疗效果。因此，该项研究是在建立移植性小鼠乳腺肿瘤(EMT6)模型基础上，观察三七虫草混合粉对EMT6生长抑制作用以及对肿瘤血管生成因子的影响，从而为临床应用提供实验参考依据。
1 实验材料
1.1 动物与细胞系
雌性BALB/C小鼠36只，体重(20±2)g，购于上海斯克莱实验动物有限公司[许可证号：SCXK(沪)2003－0003]，在南京中医药大学动物中心屏障系统SPF环境下饲养；小鼠乳腺癌细胞系(EMT6)购于第四军医大学实验动物中心。
1.2 药物与试剂
三七虫草混合粉为三七精提粉与冬虫夏草精提混合而成，由云南天秀植物科技开发有限公司提供。兔抗人八因子相关抗原(Ⅷ-RAg)多克隆抗体购自北京中山生物技术有限公司，批号30677904；免疫组化超敏鼠组织试剂盒(UltrasensitiveTM S-P)购自福州迈新生物技术开发有限公司。
1.3 仪器
超净工作台由苏州安泰空气技术有限公司生产(型号sa- cj-zFD)；离心机由上海安亭科学仪器厂生产(型号ka_1000)；莱卡倒置显微镜系德国莱卡公司产品(型号 DMIL)；Forma恒温培养箱系美国Forma公司产品(型号3111)；TSJ-Q全自动脱水机、BMJ-Ⅲ型包埋机、BMJ-Ⅲ型病理组织包埋冷冻台、PHY-Ⅲ型病理组织包埋漂烘仪均由常州市中威电子仪器厂生产。
2 实验方法
2.1 细胞培养与接种
EMT6细胞用含10%小牛血清RMPI1640培养液培养，细胞长满单层，用0.25%胰酶消化，培养液吹打离心，收集细胞，PBS稀释，镜下细胞计数，调浓度为5×106，每只小鼠以0.2 mL接种于小鼠右后背部。12 d后肿瘤长至1 g时移植。
2.2 肿瘤移植
断颈处死荷瘤小鼠，75%酒精浸泡3～5 min，取出放于超净工作台平皿中，用高压灭菌过的手术器械剪开小鼠皮肤，分离肿瘤包膜，取出肿瘤放入消毒后的PBS液清洗，称重，按每克肿瘤4 mL溶液比例加生理盐水后，剪碎瘤体，充分混合匀浆制成细胞悬液，细胞计数，调浓度为2×106，每只小鼠于右后背部皮下接种0.2 mL。
2.3 分组与给药剂量
接种第13天肿瘤长至1 mm3时(成瘤36只)随机分为三七虫草混合粉中、小剂量与模型对照组。每组12只动物。所有实验用药均按保健食品三七虫草胶囊人服用剂量换算成动物实验用药剂量，中剂量为218.4 mg/d，小剂量为109.2 mg/d。使用时配制成91 mg/mL与45.5 mg/mL两个不同浓度，每次灌胃0.6 mL，每天2次；模型对照组以生理盐水灌胃，每天0.4 mL。实验连续10 d。
2.4 计算与检测方法
于停止给药次日处死小鼠，并迅速取出瘤体称重，依据下列公式计算抑瘤率：IR=[(对照组平均瘤重－治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重]×100%。随机选择各组中6只小鼠肿瘤组织，常规石腊包埋、切片，HE染色做病理观察。并留6只小鼠肿瘤进行免疫组化染色，以检测肿瘤组织微血管密度(MVD)、血管内皮生长因子(VEGF)、金属蛋白酶组织抑制因子Ⅱ(TIMP-2)表达。染色步骤如下：①石蜡切片，脱蜡和水化后，用PBS(pH 7.4)冲洗3次，每次3～5 min。②根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。③每张切片加1滴或50 μL过氧化酶阻断液(试剂A)，室温下孵育15 min，以阻断内源性过氧化物酶的活性；PBS冲洗3次，每次5 min。④除去PBS液，每张切片加1滴或50 μL Ultra V Block(试剂B)，室温下孵育5 min；PBS冲洗4次，每次5 min。⑤除去PBS液，每张切片加1滴或50 μL Rodent Block(试剂C)，室温下孵育60～70 min；PBS冲洗4次，每次5 min。⑥除去PBS液，每张切片加1滴或50 μL的第一抗体，4 ℃过夜。⑦PBS冲洗4次，每次5 min，除去PBS液，每张切片加1滴或50 μL生物素标记的第二抗体(试剂D)，室温下孵育10～15 min。⑧PBS冲洗4次，每次5 min。除去PBS液，每张切片加1滴或50 μL链霉菌- 过氧化物酶溶液(试剂E)，室温下孵育10～15 min。PBS冲洗4次，每次5 min。⑨除去PBS液，每张切片加2滴或100 μL新鲜配制的DAB溶液。显微镜下观察3～10 min。染色结果为棕色。⑩自来水冲洗，苏木素复染，PBS或自来水冲洗返蓝，梯度酒精脱水干燥，中性树胶封固待检。
2.5 统计学方法
实验数据用SPSS12.0计算机统计软件进行统计学处理。各组计量资料采用x±s描述；等级资料采用Ridit检验。
3 结果
3.1 动物观察
通过实验过程中的动态观察，模型对照组小鼠活动减少，毛发稀疏无光泽，反应迟钝；而三七虫草中、小剂量组小鼠生长状态良好，毛发有光泽，活动灵活。
3.2 肿瘤抑制率
(见表1)表1 各组瘤重与抑瘤率(略)注：与模型对照组比较，﹡P&<0.05(下同)。
3.3 病理学观察
将预先用石蜡包埋的肿瘤组织进行切片，HE染色，在光学显微镜下进行组织病理学观察。结果显示，模型对照组癌细胞呈癌巢状排列，瘤细胞呈异型性，细胞核大小不等，胞核着色深，未见坏死。三七虫草中、小剂量组除见有肿瘤组织片状坏死，其他病理学特征与对照组比较无明显差别。
3.4 MVD检测
先用100倍焦距找出肿瘤中毛细血管热点区，再用400倍焦距进行计数。染成棕黄色的单个内皮细胞或内皮细胞簇均为一个血管计数，染色阳性部位在细胞浆。各组统计6张切片，每张切片观察3个视野中的血管数，取其平均值。管腔大于8个红细胞大小、有较厚肌层的血管不计数。结果见表2。表2 各组肿瘤组织MVD数(略)
3.5 VEGF检测
光学显微镜下观察，VEGF阳性细胞为棕黄色颗粒状，阳性表达位于细胞浆。肿瘤细胞中阳性&<5%为“+”，5%～15%为“++”，&>15%为“+++”。每组观察8张切片，结果见表3。表3 各组VEGF阳性表达结果（略）
3.6 TIMP-2测定
以免疫组织化学法半定量判断，TIMP-2阳性细胞为棕黄色颗粒状，阳性表达位于细胞浆。肿瘤组织中未见阳性细胞为“-”，阳性细胞在肿瘤细胞团中&<1/3为“+”，1/3～2/3为“++”， &>2/3为“+++”。每组观察8张切片，结果见表4。表4 各组TIMP-2表达结果（略）
4 讨论
临床应用的抗肿瘤药均需经过动物移植肿瘤实验确定抑瘤率。因此，移植性肿瘤动物模型的建立为抗肿瘤药物筛选与新药药理学研究提供了理想实验工具。目前，世界上已保留了近500多种包括各种实体瘤、腹水瘤和白血病在内的移植性肿瘤细胞体系。国内也创建了50多种移植性肿瘤细胞体系。尽管动物移植瘤有增殖速度较快、体积倍增时间短等与人实体瘤不同的细胞动力学特点，但到目前为止，移植性肿瘤动物实验仍是抗肿瘤药物最常用的方法。通过对实验动物的系统观察可以整体判断动物对抗肿瘤药物的耐受剂量、抗肿瘤效果与可能出现的不良反应。因而，目前还没有一种体外实验技术所能替代。
云南天秀植物科技开发有限公司依据三七、冬虫夏草现代研究资料，采用现代科技从三七、冬虫夏草中提取分离有效成分，并加工制备保健食品“三七虫草胶囊”，用于调整机体免疫功能，辅助用于改善肿瘤患者临床症状与生活质量。研究结果证明三七冬虫夏草混合粉具有以下作用：①能明显的抑制MET6肿瘤生长，所设两个剂量组对移植性小鼠乳腺癌抑制率分别为48.95%与37.64%，与对照组比较，具有统计学意义(P&<0.01)；②能够减少EMT6肿瘤组织MVD与降低VEGF表达水平，与对照组比较，均具有统计学意义(P&<0.01)；③可明显增加EMT6肿瘤组织TIMP-2表达水平，与对照组比较，具有统计学意义(P&<0.05)。
从以上研究结果可以看出，三七虫草混合粉对EMT6具有明显的抑制效应。其作用机制除对肿瘤细胞的直接杀伤效果外，可能与抑制肿瘤新生血管形成有一定关系。但本实验仅能证明三七虫草混合粉对EMT6具有抑制效应，对其他实体瘤是否有抑制效果以及其抗肿瘤作用是否与冬虫夏草有密切关系等问题我们正在进行研究。