作者：孔繁飞，黄清怡，孔焕宇，李莉，杨丽萍，朱嘉
【摘要】 目的 观察玉红膏对表皮干细胞增殖、分化的影响，探讨玉红膏促进创面愈合的作用机理。方法 采用大鼠全层皮肤缺损模型，完全随机法分成玉红膏组、京万红组、模型组、正常对照组。于造模后第1、3、5、7、14、21天6个时间点观察记录创面的愈合情况、完全愈合时间并取材。行表皮干细胞标志物整合素β1、转录因子p63的免疫组化染色，比较各组各观测点OD值及阳性细胞数的差异。结果 玉红膏组平均愈合时间[(13.5±0.9)d]与京万红组[(12.6±0.9)d]比较无明显差别，均优于模型组[(19.1±2.6)d]，P&<0.05；大体观察可见玉红膏组早期创面渗出物较多且浓稠；整合素β1、转录因子p63的免疫组化染色结果显示，玉红膏组、京万红组、模型组在造模后整合素β1 OD值、转录因子p63表皮层阳性细胞数均有升高，高于正常组，且差异有意义(P&<0.05)；玉红膏组、京万红组在第7天达到峰值，峰值出现的时间早于模型组，峰值的强度高于模型组，差异有意义(P&<0.05)；玉红膏组这2个指标前14 d均高于模型组(P&<0.05)；京万红组前7 d高于模型组(P&<0.05)，第14天与模型组无差异，至创面完全愈合的第21天3组无差别。结论 玉红膏有促进创面愈合的作用，机理可能与其诱导创缘残留的表皮干细胞增殖分化有关。
【关键词】 玉红膏；创面愈合；表皮干细胞；整合素β1；转录因子p63
Abstract：Objective To observe the effect of Yuhonggao on proliferation and differentiation of epidermal stem cells and investigate the mechanism of promoting wound healing. Methods The whole layer skin defection rat was used and randomly pided into 3 groups：Yuhonggao group， Jingwanhong group， model group， with normal rats as control. The condition of skin wound surface and healing time were observed and recorded， and then draw the wound skin. The p63 andβ1 integrin expression， the marker of epidermal stem cells， were measured and compared by immunohistochemistry staining. Results Average wound healing time hadn’t significant difference between the Yuhonggao group [(13.5±0.9)d] and Jingwanhong group [(12.6±0.9)d]， which were better than model group (P&<0.05). By gross observing， there were more and thick secretion of Yuhonggao group in initial stage. The results of immunohistochemistry staining of p63 andβ1 integrin illustrate the measured value of optical density of β1 integrin and positive cell population in epidermis layer of p63 advanced after damaged in Yuhonggao group， Jingwanhong group and model group， which were higher than normal group (P&<0.05). The max showed up after 7 days in Yuhonggao group and Jingwanhong group， it’s not only earlier than model group but also harder than it (P&<0.05). After damaged 14 days， the 2 indexes of Yuhonggao group were higher than model group. It’s 7 days in Jingwanhong group (P&<0.05)， it hadn’t significant difference in the 14th day， there was no difference among 3 groups on 21th day. Conclusion Yuhonggao can accelerate skin wound healing and possibly relate with promoting proliferation and differentiation of epidermal stem cells in edge of skin wound surface.
Key words：Yuhonggao；wound healing time；epidermal stem cells；β1 integrin；p63
近年来，随着干细胞研究的深入，对表皮干细胞(Epidermal stem cells，ESCs)在创伤修复中的重要作用已为人们所认识，从诱导干细胞角度来阐释中药加速受损皮肤再生的机理便成为可能。玉红膏具有清热解毒消肿、活血生肌止痛的功效，主要用于创伤肌肉不生，久不收口等。其确切的疗效已为长期临床实践所证实。本研究按名老中医朱仁康的中药外用油膏“玉红膏”为处方制备工艺，利用免疫组化染色技术，观察ESCs的标志物β1整合素及转录因子p63在各组中的表达差异，旨在揭示玉红膏促进创面愈合的机理，为玉红膏在创伤临床治疗中的应用提供科学依据。
1 实验材料
1.1 动物
清洁级健康Wistar雄性成年大鼠，体重180～210 g，中国中医科学院中医基础理论研究所实验动物中心提供，动物合格证号为SBSCXK(京)2002-2006。
1.2 主要药物、试剂及仪器
玉红膏，购自中国中医科学院广安门医院制剂中心，批号20020110；京万红，天津达仁堂达二药业有限公司产品，批号Z12020440。鼠抗人整合素β1单克隆抗体，武汉博士德生物工程有限公司产品，编号BA0290；鼠抗人转录因子p63单克隆抗体，Santa Cruz公司产品，编号sc-8431；即用型SABC免疫组化试剂盒，编号SA1022，DAB显色试剂盒，编号ED1022，均为北京中杉金桥生物工程有限公司产品。生物组织制动脱水机，天津爱华；Olympus光学显微镜；Image-Pro-Plus彩色病理图像分析系统。
2 实验方法
2.1 分组
将108只大鼠称重，按完全随机法分为玉红膏组、京万红组、模型组，每组36只动物，另设6只为正常对照。
2.2 动物造模与用药
正常对照组常规饲养不作任何处理，其余各组造模。大鼠致伤前一天电剃刀背部剃毛，24 h后，用3%戊巴比妥钠按0.1 mL/100 g剂量腹腔注射麻醉，将麻醉后的大鼠俯卧于手术固定板，75%酒精局部消毒后，在每只鼠背用剪刀剪3个直径1.8 cm的圆形全层皮肤缺损创面。玉红膏组造模后立即外敷玉红膏，每个创面0.1 g；京万红组每个创面外敷京万红0.1 g，每日定时换药2次至创面愈合；模型组创面不予处理。使用无菌垫料单笼喂养。
2.3 取材、检测指标与方法
于造模后第1、3、5、7、14、21天观察记录创面愈合情况、完全愈合时间并取材，每组每个观测点对6只动物取材。大鼠麻醉状态下，用剪刀剪取创面皮缘约(2×2)cm2，取材后用4%多聚甲醛固定液固定，常规脱水，石蜡包埋，切片。按说明书操作步骤进行整合素β1(效价1∶200)、转录因子p63(效价1∶300)的免疫组化染色，以PBS代替一抗作阴性对照。
在20倍物镜下指标整合素β1，每张标本随机在创面中心及创缘四周选取3个视野，转录因子p63在创缘表皮层选取3个视野，利用Image-Pro-Plus图像分析系统对指标整合素β1进行OD值分析，对转录因子p63行阳性细胞率统计。
2.4 统计学方法
所有计量数据以x±s表示，采用SPSS13.0统计软件对服从正态分布的组间计量资料用ANOVA方法进行单因素方差分析。
3 结果
3.1 创面愈合时间
(见表1)表1 3组大鼠全层皮肤缺损创面愈合时间比较(略)注：与模型组比较，*P&<0.05。
3.2 整合素β1、转录因子p63在皮肤组织中的表达定位
整合素β1为细胞膜着色，转录因子p63细胞核着色。在正常大鼠皮肤，整合素β1阳性细胞散在分布于表皮基底层、毛囊的外根鞘部；转录因子p63阳性细胞广泛分布于表皮基底层、毛囊及皮脂腺的上皮。在创伤皮肤，从伤后第1天开始，随着时间的推移，阳性细胞不仅分布在上述组织结构中，在表皮层由单层片状、散在分布于表皮基底层，逐渐增加为双层乃至多层，特征性的改变是棘层或颗粒层出现多个散在的阳性细胞，且越接近创面这些阳性细胞更加密集；其数量随着创面的缩小渐渐增加，至创面愈合、上皮化，这些阳性细胞仍然存在。光镜下，模型组无论从阳性细胞的体积、数量、分布排列及着色强度上均明显逊于玉红膏组和京万红组。
3.3 各组创面组织中整合素β1 OD值比较
(见表2)表2 各组创面组织中整合素β1 OD值比较(略)注：与京万红组比较，△P&<0.05；与模型组比较，*P&<0.05；与正常组比较，#P&<0.05；与第1天模型组比较，▲P&<0.05(下同)。
3.4 各组创缘表皮层中转录因子p63阳性细胞数比较
(见表3)表3 各组创缘表皮层中转录因子p63阳性细胞数比较(略)
4 讨论
在创面愈合机理的认识上，中医学认为创面愈合是一个“腐去肌生，腲脓长肉”的过程。本实验观察到玉红膏组创面分泌大量稠性分泌物。在伤口渗出液中主要包含早期渗出的炎性细胞以及由炎性细胞分泌的各种多种生长因子，主要有上皮细胞生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF)、白细胞介素-I(IL-1)等，其中EGF、bFGF、PDGF、TGF-β以及IGF-1是成纤维细胞的丝裂原，且这些因子在愈合早期渗出液中的含量较高。有研究证实，早期伤口微环境有利于修复细胞生长，源于炎性细胞的多种生长因子是早期伤口微环境利于细胞生长的主要原因[1]。有报道，EGF有促进ESCs增殖分化的作用[2]。鉴于上述的理论及本实验的研究结果，我们推测外用中药复方玉红膏的愈创机理之一可能是影响和改变了ESCs所处的微环境，从而促进ESCs的增殖分化。ESCs分化过程中常伴随细胞粘附分子、角蛋白、核蛋白及与细胞增殖有关转录因子的一系列变化，整合素家族的β1、α6，角蛋白家族的K19、K15以及转录因子p63等已被作为ESCs的特异性标志而应用于其检测与分离[4]，但这些标志物的特异性，学术界尚存在一定争论。目前多主张以其生物学特性结合两种或多种标志物对ESCs进行分离和鉴定，为此，本实验采用ESCs膜标志物整合素β1及核标志物p63分别检测创缘的ESCs。本实验结果发现，整合素β1并非全部毛囊染色阳性，只是个别毛囊隆突部染色阳性，在正常皮肤表皮的基底层阳性细胞也偶见，在创缘表皮的基底层、棘层、颗粒层可见大量阳性细胞，与以往的报道结果一致[2]。由于ESCs与短暂扩充细胞表面能表达整合素β1，而有丝分裂后细胞与终末分化细胞不表达整合素β1，故可利用整合素β1的抗体来鉴别ESCs及短暂扩充细胞[4-6]。统计分析结果表明，在损伤后的前7天，玉红膏药物组的ESCs和短暂扩充细胞的总数明显高于模型对照组，直到第14天玉红膏药物组的创面完全愈合，2组的ESCs和短暂扩充细胞的总数才没有差别，提示玉红膏有促进ESCs增殖分化的作用。转录因子p63不仅毛囊隆突部染色为阳性，在毛囊上皮皮脂腺上皮也有阳性表达，正常皮肤的表皮基底层阳性细胞遍布；在创缘表皮的基底层、棘层、颗粒层可见大量阳性细胞。由于转录因子p63在增殖能力强的细胞中表达，因此，统计分析结果表明玉红膏组表皮层细胞具有更强的增殖能力，提示玉红膏有促进细胞增殖的作用。
本实验观察到，随着创伤修复的进程，整合素β1和转录因子p63阳性表达增多。无论整合素β1的OD值还是转录因子p63在表皮层的阳性细胞数量，我们测得的数据都是逐渐升高，达到一个峰值，然后又逐渐降低的过程；药物组和模型组所不同的是，药物组先到达峰值，当创面完全上皮化后则各组比较差异不明显。笔者认为，玉红膏组由于创伤修复信号的启动和外用中药的刺激，为了适应创面修复的需要，ESCs快速增殖分化，产生了数量较多的干细胞和大量的短暂扩充细胞，因此，从免疫组化实验结果可以看出玉红膏组这2个指标的峰值强度较大、出现的较早。
实验结果显示，玉红膏具有促进创面愈合的作用，从ESCs的表面标志物的免疫组化染色结果分析，实验组与模型组比较具有统计学意义。我们认为，中药局部给药、局部吸收，改变了ESCs所处的微环境，从而影响ESCs的增殖分化。但究竟是影响了细胞因子的分泌，还是影响了细胞间的信号传导通路，或是细胞与细胞外基质之间的相互作用，还有待于进一步研究探讨。
参考文献
[1] 付小兵，王德文.现代创伤修复学[M].北京：人民军医出版社，1999.209.
[2] 付小兵，孙晓庆，孙同柱，等.表皮细胞生长因子通过诱导皮肤干细胞分化加速受创表皮再生的研究[J].中国修复重建外科杂志，2002，16(1)：31－35.
[3] Webb A， Kaur P. Epidermal stem cells[J].Front Biosci，2006， 1(11)：1031－1041.
[4] Cotsarelis G， Kaur P， Dhouailly D， et al. Epithelial stem cells in the skin：definition， markers， localization and functions[J]. Exp Dermatol，1999，83：80－88.
[5] Van der Kooy D， Weiss S. Why stem cells？[J].Science，2000，287：1439－1441.
[6] Li A， Simmons PJ， Kaur P. Identification and isolation of candidate human keratinocyte stem cells based on cell surface phenotype[J].Proc Natl Acad Sci USA，1998，95：3902－3907.
【摘要】 目的 观察玉红膏对表皮干细胞增殖、分化的影响，探讨玉红膏促进创面愈合的作用机理。方法 采用大鼠全层皮肤缺损模型，完全随机法分成玉红膏组、京万红组、模型组、正常对照组。于造模后第1、3、5、7、14、21天6个时间点观察记录创面的愈合情况、完全愈合时间并取材。行表皮干细胞标志物整合素β1、转录因子p63的免疫组化染色，比较各组各观测点OD值及阳性细胞数的差异。结果 玉红膏组平均愈合时间[(13.5±0.9)d]与京万红组[(12.6±0.9)d]比较无明显差别，均优于模型组[(19.1±2.6)d]，P&<0.05；大体观察可见玉红膏组早期创面渗出物较多且浓稠；整合素β1、转录因子p63的免疫组化染色结果显示，玉红膏组、京万红组、模型组在造模后整合素β1 OD值、转录因子p63表皮层阳性细胞数均有升高，高于正常组，且差异有意义(P&<0.05)；玉红膏组、京万红组在第7天达到峰值，峰值出现的时间早于模型组，峰值的强度高于模型组，差异有意义(P&<0.05)；玉红膏组这2个指标前14 d均高于模型组(P&<0.05)；京万红组前7 d高于模型组(P&<0.05)，第14天与模型组无差异，至创面完全愈合的第21天3组无差别。结论 玉红膏有促进创面愈合的作用，机理可能与其诱导创缘残留的表皮干细胞增殖分化有关。
【关键词】 玉红膏；创面愈合；表皮干细胞；整合素β1；转录因子p63
Effect of Yuhonggao on Proliferation and Differentiation of Epidermal Stem Cells in the Process of Rat’s Skin Wound Healing
KONG Fan-fei， HUANG Qing-yi， KONG Huan-yu， et al
The Laboratory of Pharmacology of the Wangjing Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China
Abstract：Objective To observe the effect of Yuhonggao on proliferation and differentiation of epidermal stem cells and investigate the mechanism of promoting wound healing. Methods The whole layer skin defection rat was used and randomly pided into 3 groups：Yuhonggao group， Jingwanhong group， model group， with normal rats as control. The condition of skin wound surface and healing time were observed and recorded， and then draw the wound skin. The p63 andβ1 integrin expression， the marker of epidermal stem cells， were measured and compared by immunohistochemistry staining. Results Average wound healing time hadn’t significant difference between the Yuhonggao group [(13.5±0.9)d] and Jingwanhong group [(12.6±0.9)d]， which were better than model group (P&<0.05). By gross observing， there were more and thick secretion of Yuhonggao group in initial stage. The results of immunohistochemistry staining of p63 andβ1 integrin illustrate the measured value of optical density of β1 integrin and positive cell population in epidermis layer of p63 advanced after damaged in Yuhonggao group， Jingwanhong group and model group， which were higher than normal group (P&<0.05). The max showed up after 7 days in Yuhonggao group and Jingwanhong group， it’s not only earlier than model group but also harder than it (P&<0.05). After damaged 14 days， the 2 indexes of Yuhonggao group were higher than model group. It’s 7 days in Jingwanhong group (P&<0.05)， it hadn’t significant difference in the 14th day， there was no difference among 3 groups on 21th day. Conclusion Yuhonggao can accelerate skin wound healing and possibly relate with promoting proliferation and differentiation of epidermal stem cells in edge of skin wound surface.
Key words：Yuhonggao；wound healing time；epidermal stem cells；β1 integrin；p63
近年来，随着干细胞研究的深入，对表皮干细胞(Epidermal stem cells，ESCs)在创伤修复中的重要作用已为人们所认识，从诱导干细胞角度来阐释中药加速受损皮肤再生的机理便成为可能。玉红膏具有清热解毒消肿、活血生肌止痛的功效，主要用于创伤肌肉不生，久不收口等。其确切的疗效已为长期临床实践所证实。本研究按名老中医朱仁康的中药外用油膏“玉红膏”为处方制备工艺，利用免疫组化染色技术，观察ESCs的标志物β1整合素及转录因子p63在各组中的表达差异，旨在揭示玉红膏促进创面愈合的机理，为玉红膏在创伤临床治疗中的应用提供科学依据。
1 实验材料
1.1 动物
清洁级健康Wistar雄性成年大鼠，体重180～210 g，中国中医科学院中医基础理论研究所实验动物中心提供，动物合格证号为SBSCXK(京)2002-2006。
1.2 主要药物、试剂及仪器
玉红膏，购自中国中医科学院广安门医院制剂中心，批号20020110；京万红，天津达仁堂达二药业有限公司产品，批号Z12020440。鼠抗人整合素β1单克隆抗体，武汉博士德生物工程有限公司产品，编号BA0290；鼠抗人转录因子p63单克隆抗体，Santa Cruz公司产品，编号sc-8431；即用型SABC免疫组化试剂盒，编号SA1022，DAB显色试剂盒，编号ED1022，均为北京中杉金桥生物工程有限公司产品。生物组织制动脱水机，天津爱华；Olympus光学显微镜；Image-Pro-Plus彩色病理图像分析系统。
2 实验方法
2.1 分组
将108只大鼠称重，按完全随机法分为玉红膏组、京万红组、模型组，每组36只动物，另设6只为正常对照。
2.2 动物造模与用药
正常对照组常规饲养不作任何处理，其余各组造模。大鼠致伤前一天电剃刀背部剃毛，24 h后，用3%戊巴比妥钠按0.1 mL/100 g剂量腹腔注射麻醉，将麻醉后的大鼠俯卧于手术固定板，75%酒精局部消毒后，在每只鼠背用剪刀剪3个直径1.8 cm的圆形全层皮肤缺损创面。玉红膏组造模后立即外敷玉红膏，每个创面0.1 g；京万红组每个创面外敷京万红0.1 g，每日定时换药2次至创面愈合；模型组创面不予处理。使用无菌垫料单笼喂养。
2.3 取材、检测指标与方法
于造模后第1、3、5、7、14、21天观察记录创面愈合情况、完全愈合时间并取材，每组每个观测点对6只动物取材。大鼠麻醉状态下，用剪刀剪取创面皮缘约(2×2)cm2，取材后用4%多聚甲醛固定液固定，常规脱水，石蜡包埋，切片。按说明书操作步骤进行整合素β1(效价1∶200)、转录因子p63(效价1∶300)的免疫组化染色，以PBS代替一抗作阴性对照。
在20倍物镜下指标整合素β1，每张标本随机在创面中心及创缘四周选取3个视野，转录因子p63在创缘表皮层选取3个视野，利用Image-Pro-Plus图像分析系统对指标整合素β1进行OD值分析，对转录因子p63行阳性细胞率统计。
2.4 统计学方法
所有计量数据以x±s表示，采用SPSS13.0统计软件对服从正态分布的组间计量资料用ANOVA方法进行单因素方差分析。
3 结果
3.1 创面愈合时间
(见表1)表1 3组大鼠全层皮肤缺损创面愈合时间比较(略)注：与模型组比较，*P&<0.05。
3.2 整合素β1、转录因子p63在皮肤组织中的表达定位
整合素β1为细胞膜着色，转录因子p63细胞核着色。在正常大鼠皮肤，整合素β1阳性细胞散在分布于表皮基底层、毛囊的外根鞘部；转录因子p63阳性细胞广泛分布于表皮基底层、毛囊及皮脂腺的上皮。在创伤皮肤，从伤后第1天开始，随着时间的推移，阳性细胞不仅分布在上述组织结构中，在表皮层由单层片状、散在分布于表皮基底层，逐渐增加为双层乃至多层，特征性的改变是棘层或颗粒层出现多个散在的阳性细胞，且越接近创面这些阳性细胞更加密集；其数量随着创面的缩小渐渐增加，至创面愈合、上皮化，这些阳性细胞仍然存在。光镜下，模型组无论从阳性细胞的体积、数量、分布排列及着色强度上均明显逊于玉红膏组和京万红组。
3.3 各组创面组织中整合素β1 OD值比较
(见表2)表2 各组创面组织中整合素β1 OD值比较(略)注：与京万红组比较，△P&<0.05；与模型组比较，*P&<0.05；与正常组比较，#P&<0.05；与第1天模型组比较，▲P&<0.05(下同)。
3.4 各组创缘表皮层中转录因子p63阳性细胞数比较
(见表3)表3 各组创缘表皮层中转录因子p63阳性细胞数比较(略)
4 讨论
在创面愈合机理的认识上，中医学认为创面愈合是一个“腐去肌生，腲脓长肉”的过程。本实验观察到玉红膏组创面分泌大量稠性分泌物。在伤口渗出液中主要包含早期渗出的炎性细胞以及由炎性细胞分泌的各种多种生长因子，主要有上皮细胞生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF)、白细胞介素-I(IL-1)等，其中EGF、bFGF、PDGF、TGF-β以及IGF-1是成纤维细胞的丝裂原，且这些因子在愈合早期渗出液中的含量较高。有研究证实，早期伤口微环境有利于修复细胞生长，源于炎性细胞的多种生长因子是早期伤口微环境利于细胞生长的主要原因[1]。有报道，EGF有促进ESCs增殖分化的作用[2]。鉴于上述的理论及本实验的研究结果，我们推测外用中药复方玉红膏的愈创机理之一可能是影响和改变了ESCs所处的微环境，从而促进ESCs的增殖分化。ESCs分化过程中常伴随细胞粘附分子、角蛋白、核蛋白及与细胞增殖有关转录因子的一系列变化，整合素家族的β1、α6，角蛋白家族的K19、K15以及转录因子p63等已被作为ESCs的特异性标志而应用于其检测与分离[4]，但这些标志物的特异性，学术界尚存在一定争论。目前多主张以其生物学特性结合两种或多种标志物对ESCs进行分离和鉴定，为此，本实验采用ESCs膜标志物整合素β1及核标志物p63分别检测创缘的ESCs。本实验结果发现，整合素β1并非全部毛囊染色阳性，只是个别毛囊隆突部染色阳性，在正常皮肤表皮的基底层阳性细胞也偶见，在创缘表皮的基底层、棘层、颗粒层可见大量阳性细胞，与以往的报道结果一致[2]。由于ESCs与短暂扩充细胞表面能表达整合素β1，而有丝分裂后细胞与终末分化细胞不表达整合素β1，故可利用整合素β1的抗体来鉴别ESCs及短暂扩充细胞[4-6]。统计分析结果表明，在损伤后的前7天，玉红膏药物组的ESCs和短暂扩充细胞的总数明显高于模型对照组，直到第14天玉红膏药物组的创面完全愈合，2组的ESCs和短暂扩充细胞的总数才没有差别，提示玉红膏有促进ESCs增殖分化的作用。转录因子p63不仅毛囊隆突部染色为阳性，在毛囊上皮皮脂腺上皮也有阳性表达，正常皮肤的表皮基底层阳性细胞遍布；在创缘表皮的基底层、棘层、颗粒层可见大量阳性细胞。由于转录因子p63在增殖能力强的细胞中表达，因此，统计分析结果表明玉红膏组表皮层细胞具有更强的增殖能力，提示玉红膏有促进细胞增殖的作用。
本实验观察到，随着创伤修复的进程，整合素β1和转录因子p63阳性表达增多。无论整合素β1的OD值还是转录因子p63在表皮层的阳性细胞数量，我们测得的数据都是逐渐升高，达到一个峰值，然后又逐渐降低的过程；药物组和模型组所不同的是，药物组先到达峰值，当创面完全上皮化后则各组比较差异不明显。笔者认为，玉红膏组由于创伤修复信号的启动和外用中药的刺激，为了适应创面修复的需要，ESCs快速增殖分化，产生了数量较多的干细胞和大量的短暂扩充细胞，因此，从免疫组化实验结果可以看出玉红膏组这2个指标的峰值强度较大、出现的较早。
实验结果显示，玉红膏具有促进创面愈合的作用，从ESCs的表面标志物的免疫组化染色结果分析，实验组与模型组比较具有统计学意义。我们认为，中药局部给药、局部吸收，改变了ESCs所处的微环境，从而影响ESCs的增殖分化。但究竟是影响了细胞因子的分泌，还是影响了细胞间的信号传导通路，或是细胞与细胞外基质之间的相互作用，还有待于进一步研究探讨。
参考文献
[1] 付小兵，王德文.现代创伤修复学[M].北京：人民军医出版社，1999.209.
[2] 付小兵，孙晓庆，孙同柱，等.表皮细胞生长因子通过诱导皮肤干细胞分化加速受创表皮再生的研究[J].中国修复重建外科杂志，2002，16(1)：31－35.
[3] Webb A， Kaur P. Epidermal stem cells[J].Front Biosci，2006， 1(11)：1031－1041.
[4] Cotsarelis G， Kaur P， Dhouailly D， et al. Epithelial stem cells in the skin：definition， markers， localization and functions[J]. Exp Dermatol，1999，83：80－88.
[5] Van der Kooy D， Weiss S. Why stem cells？[J].Science，2000，287：1439－1441.
[6] Li A， Simmons PJ， Kaur P. Identification and isolation of candidate human keratinocyte stem cells based on cell surface phenotype[J].Proc Natl Acad Sci USA，1998，95：3902－3907.