【摘要】 目的 观察平喘宁对哮喘豚鼠白三烯B4(LTB4)、可溶性细胞间粘附分子-1(sICAM-1)含量的影响，探讨其治疗哮喘的相关生物学机制。方法 以卵蛋白致敏复制豚鼠哮喘病模型，观察豚鼠引喘潜伏期的变化；运用酶联免疫吸附反应技术(ELISA)测定豚鼠血清中的LTB4和支气肺泡灌洗液(BALF)sICAM-1的含量。结果 平喘宁给药后，豚鼠的引喘潜伏期显著延长；平喘宁能显著降低哮喘豚鼠血清中LTB4和支气管肺泡灌洗液(BALF)中sICAM-1含量，与哮喘模型组比较，P&<0.05或P&<0.01。结论 平喘宁具有明显平喘作用，其作用机制与降低哮喘豚鼠血清中LTB4和BALF中sICAM-1的含量有关。
【关键词】 平喘宁；哮喘；可溶性细胞间粘附分子-1；白三烯B4
Abstract：Objective To observe the effect of Pingchuanning on the levels of LTB4 and sICAM-1 of guinea pigs with asthma. Methods The model guinea pigs of asthma were sensitized with ovalbumin (OVA)， the changes of the delitescence of asthma was observed. The levels of LTB4 in serum and sICAM-1 in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were also observed by means of enzyme-linked immunosorbent (ELISA). Result Comparing with the model group， the delitescence of asthma was obviously prolonged in guinea pigs treated by Pingchuanning. The levels of LTB4 and sICAM-1 of guinea pigs with asthma treated by Pingchuanning were significantly lowered (P&<0.01 or P&<0.05). Conclusion Pingchuanning has obviously effect of treating asthma and its mechanism is probably due to the decrease of LTB4 and sICAM-1.
Key words：Pingchuanning；asthma；sICAM-1；LTB4
支气管哮喘是一种气道的慢性炎症性疾患，许多细胞(如嗜酸粒细胞、肥大细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等)和细胞组分在哮喘发病过程中起作用。上述炎性细胞能合成和释放肿瘤坏死因子、细胞间粘附分子-1(sICAM-1)、血小板活化因子(PAF)、白三烯(LTs)等大量炎性介质和细胞因子，引发气道炎症。气道炎症导致气道高反应性的加重。本研究通过复制豚鼠哮喘病模型，主要观察平喘宁对实验动物血清中白三烯B4(LTB4)、支气管肺泡灌洗液(BALF)中sICAM-1含量的影响，评价其治疗哮喘的相关生物学机制。
1 实验材料
1.1 动物
雄性健康豚鼠80只，体重250～350 g，安徽医科大学实验动物中心提供，合格证号：皖医动实准第01号。
1.2 药物与试剂
平喘宁由麻黄、细辛、苏子、杏仁、半夏、陈皮、地龙、五味子等中药依处方比例组成。中药饮片由安徽中医学院国医堂提供。经水煎煮制成合剂，依剂量的大小分别制成浓度为含原药材4.2(大剂量)、2.1(中剂量)、1.05 g/mL(小剂量)。醋酸地塞米松片，每片0.75 mg，信谊药业有限公司，批号040722。氨茶碱片，每片0.1 mg，南京白敬宇制药厂，批号040606。桂龙咳喘宁，山西桂龙医药有限公司，批号031209。卵白蛋白， Sigma公司(A5253)。豚鼠LTB4 ELISA检测试剂盒TPI InC USA(041567)，豚鼠sICAM-1 ELISA检测试剂盒DR Lab Caliornia USA(2004090517)。
1.3 主要仪器
402AI型医用超声雾化器，江苏鱼跃医疗设备有限公司， Spectra Classic型酶标分析仪。
2 实验方法
2.1 分组
将80只健康雄性豚鼠随机分为8组，每组10只。即正常组、模型组、平喘宁大剂量组、平喘宁中剂量组、平喘宁小剂量组、地塞米松组、氨茶碱组、桂龙咳喘宁组。
2.2 造模[1]
豚鼠腹腔注射含10%卵蛋白的生理盐水1 mL致敏。自注射第14天起，每天上、下午各1次将豚鼠置于气雾缸内(正常组除外)，用1%卵蛋白溶液超声雾化，进行诱喘攻击，至哮喘发作。当豚鼠出现咳嗽、呼吸困难和喘息、点头、抽搐，提示造模成功，连续7 d。
2.3 给药
正常组：按造模组方法，用生理盐水代替卵蛋白作腹腔注射与雾化吸入。自注射第14天起，给予等体积生理盐水灌胃。模型组：自注射第14天起，按上述方法造模致敏豚鼠，给予等体积生理盐水灌胃。平喘宁组：按上述方法造模致敏豚鼠，每天给予平喘宁灌服(其大、中、小剂量组按4∶2∶1进行浓缩)。地塞米松组：按上述方法造模致敏豚鼠，每天给予灌服地塞米松，剂量为0.4 mg/kg。氨茶碱组：按上述方法造模致敏豚鼠，每天给予灌服氨茶碱，剂量为0.08 g/kg。桂龙咳喘宁组：按上述方法造模致敏豚鼠，每天给予灌服桂龙咳喘宁，剂量为10.00 g/kg。各组均于当天两次激发间隔时间内给药，每天1次，连续7 d。
2.4 豚鼠血清的收集
将豚鼠用25%乌拉坦按照1.2 g/kg腹腔注射麻醉后，固定于手术台，打开腹腔，快速抽取腹主动脉血液约5 mL，注入无菌试管，置于室温约1 h后，以1 500 r/min离心30 min，无菌吸取上层血清装于无菌瓶内，储存-20 ℃冰箱备用。
2.5 豚鼠BALF收集[2]
将豚鼠用25%乌拉坦按照1.2 g/kg腹腔注射麻醉后，固定于手术台上，在下颌下沿支气管方向做一切口，切开皮肤，分离暴露气管，在气管上方做一“Ｔ”形切口，插入注射针头，扎紧，用10 mL注射器抽取PBS液进行灌洗，每次抽取3 mL，经反复灌洗5～6次后，吸出灌洗液，计5次，加入标号的试管中，灌洗液回收率应达80%以上。
2.6 观察指标
2.6.1 引喘潜伏期[3]
实验第14天，将豚鼠放入4 L的玻璃罩内，喷入1%卵蛋白气雾。观察豚鼠喘息动作(咳嗽、呼吸困难和喘息、点头、抽搐)，记录其引喘潜伏期(由喷入1%卵蛋白开始至哮喘发作所需的时间)。末次给药后再次观察引喘潜伏期。
2.6.2 血清中LTB4的检测
采用酶联免疫吸附反应技术(ELISA)，按说明书进行操作。酶标仪在450 nm波长下读取吸光度A值，以标准品A值绘制标准曲线，未知含量从标准曲线查得。
2.6.3 BALF中sICAM-1的检测
BALF 1 000 r/min，离心10 min，上清液-20 ℃保存，采用ELISA法测定，按照试剂盒说明书操作。
2.7 统计学方法
数据采用x±s，所有统计应用SPSS10.0软件进行。
3 结果
(见表1、表2)表1 各组豚鼠引喘潜伏期的比较(略)注：与模型组比较，*P&<0.01；与本组给药前比较，▲P&<0.01。表2 各组豚鼠BALF中sICAM-1及血清中LTB4含量的比较(略)注：与模型组比较，#P&<0.05，##P&<0.01；与正常组比较，●P&<0.05，●●P&<0.01。
4 讨论
细胞粘附分子是众多介导细胞间或细胞与细胞外基质间相互接触和结合分子的统称。目前，研究较多且与哮喘有关的粘附分子主要包括：细胞间粘附分子(ICAM-1)、血管细胞间粘附分子(VCAM-1)和整合素家族的极迟抗原4(VLA-4)。其中ICAM-1在过敏性炎症形成过程中起关键作用。ICAM-1在哮喘发病中主要作用是介导炎症细胞，特别是嗜酸性粒细胞的聚集和跨血管内皮转移至炎症部位，释放多种炎症介质，而导致气道高反应性，也可能直接参与变态反应性炎症或作为鼻病毒受体，介导鼻病毒感染后引起气道炎症和AHR[4]。白细胞、血管内皮细胞或其他细胞表面的粘附分子可以被内吞进入细胞，也可以脱落下来，进入血液成为可溶性粘附分子。此外某些粘附分子的mRNA存在着不同的剪接形式，其中有的mRNA翻译后可能不表达在细胞表面，而是直接进入血液，成为可溶性粘附分子的另一个重要来源。除血清外，某些可溶性粘附分子还可在脑脊液、BALF、腹水等中出现，反映了局部粘附分子的表达可代谢状态。sICAM-1是血清中与细胞表面ICAM-1同型的蛋白分子，同样具有与淋巴细胞功能相关抗原1结合的活性，可通过与ICAM-1竞争配体而起到调节气道炎症的作
用，sICAM-1的升高反映了气道局部细胞表面ICAM-1表达的上调[5]。
本实验研究证实：抗原激发后哮喘豚鼠BALF中sICAM-1含量显著升高，提示sICAM-1可能参与了哮喘的发病过程，其在哮喘中的作用机制可能是增强EOS的氧化代谢过程，增加其颗粒毒性蛋白的释放，而导致AHR。而经过平喘宁治疗后明显降低，提示平喘宁有明显的抑制气道炎症作用。
LTB4同花生四烯酸其他代谢产物，如PGs、LTA4等类似，主要由中性粒细胞产生。它是一种局部作用的炎性介质，可趋化中性粒细胞，对EOS具轻微趋化作用，体内研究表明LTB4能促使白细胞从血管进入组织间隙。接触LTB4后多核白细胞迅速聚集，稍后便出现EOS的聚集，LTB4还可刺激超氧阴离子分泌及白细胞释放其颗粒成分，并影响B淋巴细胞低亲和力IgE受体的表达。研究表明，虽然LTB4无直接收缩支气管平滑肌的作用，但它具有强大的中性粒细胞和EOS趋化作用，比5HETE强100倍。
本实验结果显示哮喘模型组豚鼠血清中LTB4表达水平较正常组显著升高，提示LTB4水平增高在哮喘的发病中起一定的作用。其原因可能是LTB4促进中性粒细胞在气道的聚集，从而介导一系列的炎症过程。平喘宁各剂量组均能显著降低豚鼠血清中LTB4水平以达到阻止炎性递质释放而治疗哮喘的目的。
实验研究结果表明平喘宁能明显延长哮喘豚鼠的引喘潜伏期，降低哮喘豚鼠BALF中sICAM-1及血清中LTB4水平，提示平喘宁具有平喘作用，而其通过对相关细胞因子的调节而减轻哮喘炎症，降低气道高反应性，可能是本药治疗哮喘的作用机制之一。
【参考文献】
[1] 郭 鹞.人类疾病的动物模型复制[M].北京：人民卫生出版社，1982.235－236.
[2] 陈 奇.中药药理研究方法学[M].北京：人民卫生出版社，2000.1103－1104.
[3] 刘 宏，赵鸣武，耿秋明，等.博本霉素致肺纤维化大鼠支气管肺泡灌洗液磷脂组分变化[J].中华结核和呼吸杂志，1993，16(4)：197－201.
[4] Ciprandi G， Tosca MA， Fasce L， et al. Allergen specific conjunctinal challenge in children with allergic asthma， A clinical tool[J]. Allergy，1994，49(6)：489.
[5] Shiota Y， Wilson JG， Marukawa M， et al. Soluble intercellular hesion molecule(ICAM-1) antigenin sera of bronchial asthmatics[J]. Chest，1996，109：94.
【摘要】 目的 观察平喘宁对哮喘豚鼠白三烯B4(LTB4)、可溶性细胞间粘附分子-1(sICAM-1)含量的影响，探讨其治疗哮喘的相关生物学机制。方法 以卵蛋白致敏复制豚鼠哮喘病模型，观察豚鼠引喘潜伏期的变化；运用酶联免疫吸附反应技术(ELISA)测定豚鼠血清中的LTB4和支气肺泡灌洗液(BALF)sICAM-1的含量。结果 平喘宁给药后，豚鼠的引喘潜伏期显著延长；平喘宁能显著降低哮喘豚鼠血清中LTB4和支气管肺泡灌洗液(BALF)中sICAM-1含量，与哮喘模型组比较，P&<0.05或P&<0.01。结论 平喘宁具有明显平喘作用，其作用机制与降低哮喘豚鼠血清中LTB4和BALF中sICAM-1的含量有关。
【关键词】 平喘宁；哮喘；可溶性细胞间粘附分子-1；白三烯B4
Effect of Pingchuanning on the Levels of LTB4 and sICAM-1 of Guinea Pigs with Asthma
ZHAO Bao-lin， FANG Xiang-ming
1.Anhui Junior College of TCM， Wuhu 241000， China；2. Anhui College of TCM， Hefei 230038， China
Abstract：Objective To observe the effect of Pingchuanning on the levels of LTB4 and sICAM-1 of guinea pigs with asthma. Methods The model guinea pigs of asthma were sensitized with ovalbumin (OVA)， the changes of the delitescence of asthma was observed. The levels of LTB4 in serum and sICAM-1 in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were also observed by means of enzyme-linked immunosorbent (ELISA). Result Comparing with the model group， the delitescence of asthma was obviously prolonged in guinea pigs treated by Pingchuanning. The levels of LTB4 and sICAM-1 of guinea pigs with asthma treated by Pingchuanning were significantly lowered (P&<0.01 or P&<0.05). Conclusion Pingchuanning has obviously effect of treating asthma and its mechanism is probably due to the decrease of LTB4 and sICAM-1.
Key words：Pingchuanning；asthma；sICAM-1；LTB4
支气管哮喘是一种气道的慢性炎症性疾患，许多细胞(如嗜酸粒细胞、肥大细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等)和细胞组分在哮喘发病过程中起作用。上述炎性细胞能合成和释放肿瘤坏死因子、细胞间粘附分子-1(sICAM-1)、血小板活化因子(PAF)、白三烯(LTs)等大量炎性介质和细胞因子，引发气道炎症。气道炎症导致气道高反应性的加重。本研究通过复制豚鼠哮喘病模型，主要观察平喘宁对实验动物血清中白三烯B4(LTB4)、支气管肺泡灌洗液(BALF)中sICAM-1含量的影响，评价其治疗哮喘的相关生物学机制。
1 实验材料
1.1 动物
雄性健康豚鼠80只，体重250～350 g，安徽医科大学实验动物中心提供，合格证号：皖医动实准第01号。
1.2 药物与试剂
平喘宁由麻黄、细辛、苏子、杏仁、半夏、陈皮、地龙、五味子等中药依处方比例组成。中药饮片由安徽中医学院国医堂提供。经水煎煮制成合剂，依剂量的大小分别制成浓度为含原药材4.2(大剂量)、2.1(中剂量)、1.05 g/mL(小剂量)。醋酸地塞米松片，每片0.75 mg，信谊药业有限公司，批号040722。氨茶碱片，每片0.1 mg，南京白敬宇制药厂，批号040606。桂龙咳喘宁，山西桂龙医药有限公司，批号031209。卵白蛋白， Sigma公司(A5253)。豚鼠LTB4 ELISA检测试剂盒TPI InC USA(041567)，豚鼠sICAM-1 ELISA检测试剂盒DR Lab Caliornia USA(2004090517)。
1.3 主要仪器
402AI型医用超声雾化器，江苏鱼跃医疗设备有限公司， Spectra Classic型酶标分析仪。
2 实验方法
2.1 分组
将80只健康雄性豚鼠随机分为8组，每组10只。即正常组、模型组、平喘宁大剂量组、平喘宁中剂量组、平喘宁小剂量组、地塞米松组、氨茶碱组、桂龙咳喘宁组。
2.2 造模[1]
豚鼠腹腔注射含10%卵蛋白的生理盐水1 mL致敏。自注射第14天起，每天上、下午各1次将豚鼠置于气雾缸内(正常组除外)，用1%卵蛋白溶液超声雾化，进行诱喘攻击，至哮喘发作。当豚鼠出现咳嗽、呼吸困难和喘息、点头、抽搐，提示造模成功，连续7 d。
2.3 给药
正常组：按造模组方法，用生理盐水代替卵蛋白作腹腔注射与雾化吸入。自注射第14天起，给予等体积生理盐水灌胃。模型组：自注射第14天起，按上述方法造模致敏豚鼠，给予等体积生理盐水灌胃。平喘宁组：按上述方法造模致敏豚鼠，每天给予平喘宁灌服(其大、中、小剂量组按4∶2∶1进行浓缩)。地塞米松组：按上述方法造模致敏豚鼠，每天给予灌服地塞米松，剂量为0.4 mg/kg。氨茶碱组：按上述方法造模致敏豚鼠，每天给予灌服氨茶碱，剂量为0.08 g/kg。桂龙咳喘宁组：按上述方法造模致敏豚鼠，每天给予灌服桂龙咳喘宁，剂量为10.00 g/kg。各组均于当天两次激发间隔时间内给药，每天1次，连续7 d。
2.4 豚鼠血清的收集
将豚鼠用25%乌拉坦按照1.2 g/kg腹腔注射麻醉后，固定于手术台，打开腹腔，快速抽取腹主动脉血液约5 mL，注入无菌试管，置于室温约1 h后，以1 500 r/min离心30 min，无菌吸取上层血清装于无菌瓶内，储存-20 ℃冰箱备用。
2.5 豚鼠BALF收集[2]
将豚鼠用25%乌拉坦按照1.2 g/kg腹腔注射麻醉后，固定于手术台上，在下颌下沿支气管方向做一切口，切开皮肤，分离暴露气管，在气管上方做一“Ｔ”形切口，插入注射针头，扎紧，用10 mL注射器抽取PBS液进行灌洗，每次抽取3 mL，经反复灌洗5～6次后，吸出灌洗液，计5次，加入标号的试管中，灌洗液回收率应达80%以上。
2.6 观察指标
2.6.1 引喘潜伏期[3]
实验第14天，将豚鼠放入4 L的玻璃罩内，喷入1%卵蛋白气雾。观察豚鼠喘息动作(咳嗽、呼吸困难和喘息、点头、抽搐)，记录其引喘潜伏期(由喷入1%卵蛋白开始至哮喘发作所需的时间)。末次给药后再次观察引喘潜伏期。
2.6.2 血清中LTB4的检测
采用酶联免疫吸附反应技术(ELISA)，按说明书进行操作。酶标仪在450 nm波长下读取吸光度A值，以标准品A值绘制标准曲线，未知含量从标准曲线查得。
2.6.3 BALF中sICAM-1的检测
BALF 1 000 r/min，离心10 min，上清液-20 ℃保存，采用ELISA法测定，按照试剂盒说明书操作。
2.7 统计学方法
数据采用x±s，所有统计应用SPSS10.0软件进行。
3 结果
(见表1、表2)表1 各组豚鼠引喘潜伏期的比较(略)注：与模型组比较，*P&<0.01；与本组给药前比较，▲P&<0.01。表2 各组豚鼠BALF中sICAM-1及血清中LTB4含量的比较(略)注：与模型组比较，#P&<0.05，##P&<0.01；与正常组比较，●P&<0.05，●●P&<0.01。
4 讨论
细胞粘附分子是众多介导细胞间或细胞与细胞外基质间相互接触和结合分子的统称。目前，研究较多且与哮喘有关的粘附分子主要包括：细胞间粘附分子(ICAM-1)、血管细胞间粘附分子(VCAM-1)和整合素家族的极迟抗原4(VLA-4)。其中ICAM-1在过敏性炎症形成过程中起关键作用。ICAM-1在哮喘发病中主要作用是介导炎症细胞，特别是嗜酸性粒细胞的聚集和跨血管内皮转移至炎症部位，释放多种炎症介质，而导致气道高反应性，也可能直接参与变态反应性炎症或作为鼻病毒受体，介导鼻病毒感染后引起气道炎症和AHR[4]。白细胞、血管内皮细胞或其他细胞表面的粘附分子可以被内吞进入细胞，也可以脱落下来，进入血液成为可溶性粘附分子。此外某些粘附分子的mRNA存在着不同的剪接形式，其中有的mRNA翻译后可能不表达在细胞表面，而是直接进入血液，成为可溶性粘附分子的另一个重要来源。除血清外，某些可溶性粘附分子还可在脑脊液、BALF、腹水等中出现，反映了局部粘附分子的表达可代谢状态。sICAM-1是血清中与细胞表面ICAM-1同型的蛋白分子，同样具有与淋巴细胞功能相关抗原1结合的活性，可通过与ICAM-1竞争配体而起到调节气道炎症的作
用，sICAM-1的升高反映了气道局部细胞表面ICAM-1表达的上调[5]。
本实验研究证实：抗原激发后哮喘豚鼠BALF中sICAM-1含量显著升高，提示sICAM-1可能参与了哮喘的发病过程，其在哮喘中的作用机制可能是增强EOS的氧化代谢过程，增加其颗粒毒性蛋白的释放，而导致AHR。而经过平喘宁治疗后明显降低，提示平喘宁有明显的抑制气道炎症作用。
LTB4同花生四烯酸其他代谢产物，如PGs、LTA4等类似，主要由中性粒细胞产生。它是一种局部作用的炎性介质，可趋化中性粒细胞，对EOS具轻微趋化作用，体内研究表明LTB4能促使白细胞从血管进入组织间隙。接触LTB4后多核白细胞迅速聚集，稍后便出现EOS的聚集，LTB4还可刺激超氧阴离子分泌及白细胞释放其颗粒成分，并影响B淋巴细胞低亲和力IgE受体的表达。研究表明，虽然LTB4无直接收缩支气管平滑肌的作用，但它具有强大的中性粒细胞和EOS趋化作用，比5HETE强100倍。
本实验结果显示哮喘模型组豚鼠血清中LTB4表达水平较正常组显著升高，提示LTB4水平增高在哮喘的发病中起一定的作用。其原因可能是LTB4促进中性粒细胞在气道的聚集，从而介导一系列的炎症过程。平喘宁各剂量组均能显著降低豚鼠血清中LTB4水平以达到阻止炎性递质释放而治疗哮喘的目的。
实验研究结果表明平喘宁能明显延长哮喘豚鼠的引喘潜伏期，降低哮喘豚鼠BALF中sICAM-1及血清中LTB4水平，提示平喘宁具有平喘作用，而其通过对相关细胞因子的调节而减轻哮喘炎症，降低气道高反应性，可能是本药治疗哮喘的作用机制之一。
【参考文献】
[1] 郭 鹞.人类疾病的动物模型复制[M].北京：人民卫生出版社，1982.235－236.
[2] 陈 奇.中药药理研究方法学[M].北京：人民卫生出版社，2000.1103－1104.
[3] 刘 宏，赵鸣武，耿秋明，等.博本霉素致肺纤维化大鼠支气管肺泡灌洗液磷脂组分变化[J].中华结核和呼吸杂志，1993，16(4)：197－201.
[4] Ciprandi G， Tosca MA， Fasce L， et al. Allergen specific conjunctinal challenge in children with allergic asthma， A clinical tool[J]. Allergy，1994，49(6)：489.
[5] Shiota Y， Wilson JG， Marukawa M， et al. Soluble intercellular hesion molecule(ICAM-1) antigenin sera of bronchial asthmatics[J]. Chest，1996，109：94.